生物技術實驗謔狳B驟:

一、大腸桿菌(Escherichia coli)的培養

    以LB培養液(Luria或Lenox broth)培養E.Coli, 高溫高壓消毒後使用.

    若製作平盤或洋菜斜面, 則在上述成分外, 再加1.5﹪(w/v)的洋菜粉.若尚需加入抗生素等, 可在消毒後, 待液體冷卻至約50℃時, 加入混和.

    若製作軟洋菜覆蓋層之洋菜, 則用0.7﹪(w/v)的洋菜量即可. 一般若添加抗生素, 其濃度如下:

 

儲存液濃度

使用液濃度

Ampicillin

4mg/ml

50μg/ml

Chloramphenicol

10mg/ml

(溶於甲醇)

20μg/ml

    若是加其他化合物, 參考濃度如下:

 

儲存濃度

使用液濃度

Isopropyl-I-

100mM

0.1mM

thio-β-D-

(23.8mg/ml)

(每平盤加儲存液40μl)

galactoside (IPTG)

 

 

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-

20mg/ml

20ug/ml

galactoside(X-ga

(溶於N.N.dimethyl)

(每平盤加儲存液100μl)

l)

Formamide

 

    E.coli培養在LB中, 37℃, 300rpm, 振盪培養過夜, 可得約         1-2×107cells/ml, 亦可用光譜儀測0D600, 大約每0.10D相當108cells/ml, 亦可用稀釋塗平盤法計算Colony Forming Unit (CFU)/ml, 若想分離此菌, 可以稀釋塗平法或平盤劃線法為之. 保存此菌, 可將此菌加入下列兩種溶液中任一種, 並保存在-70℃, 需用時, 吸取部分, 用於培養即可.

溶液一:glycerol solution

65﹪glycerol (v/v)

0.1M MgSO4

0.025M Tris.Cl, pH8

溶液二:DMSO Solution

7﹪(v/v) dimethylsulforide (DMSO)

溶液一需經高溫高壓消毒, 溶液二不必.

      E.coli成長曲線

材料與方法

LB培養液及平盤

E.coli

自動計時器

生理實鹽水(0.9﹪)4.9ml in 13×100螺蓋試管(均經消毒)

Micropipettor

pipette tips

Spreader

37℃ incubatorn

37℃恆溫振盪培養箱

本生燈

酒精

以稀釋塗平盤法為之, 每30min計數一次, 以180分鐘為之.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二、質體(Plasmid)

    所有用於嫁接媒介(cloning vectors)的質體, 均有三個條件:

1.    一個複製起始點(a replicator)

2.    一個可選擇的標誌(a selectable marker)

3.    一個嫁接區(a cloning site)

    為使質體量多, 可以抗生素chloramphenicol適當處理, 使質體在菌體內大量繁殖.其原因為chloramphenicol抑制蛋白質生成,卻不抑制DNA合成。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三、使用Bio-Rad Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit之方法

1.     將含plasmids的菌液1.5ml加入離心管, 離心13,000rpm, 30sec, 吸除上清.

2.     在離心管中加入200μl cell suspension solution, 中速vortex 20sec, 再加入250μl cell lysis solution, 緩緩將離心管正倒轉30次, 再加入250μl neutralization solution, 緩緩將離心管正倒轉30次.

3.     離心13,000rpm, 5min, 上清液中含plasmids.

4.     準備套好1支Spin filter在1個1.5或2ml離心管中, 將上清液吸入, 再吸入200μl quantum prep matrix(必須充份混勻後使用), 並吸上吸下混合, 離心13,000rpm, 30sec.

5.     倒去液體, 重套好Spin filter, 加入500μl wash buffer(此wash buffer須已加入等量酒精), 離心13,000rpm, 30sec.

6.     倒去液體, 重套好Spin filter, 再加入500μl wash buffer, 離心13,000rpm, 2min.

7.     Spin filter置入1支新離心管中, 再加入100μl(此量可依所需plasmids濃度調整)已加熱至70℃之dH2O, 離心13,000rpm, 1min,所得即plasmids.

8.     保存於-20℃.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

四、質體轉植

將質體由一種帶此質體的菌種中提純後, 再轉植入另一不帶此質體的菌種中, 並以此質體所帶的可選擇性標誌來檢測轉植結果.

 

   

   

以提純之含Lac Z之質體(並含抗生素Amp, Tetracycline或其他抗生素標誌).

不含此質體, 且不能代謝Lactose之菌種.

2X transformation and storage solution(TSS).

[配方] 將40﹪(W/V)之PEG3350以LB稀釋至20﹪(此PEG液及LB液均經消毒過). 且此LB液中含有10mM之MgCl2, 之後加DMSO至10﹪(V/V), 並調整pH至6.5.

LB液含20mM Glucose

   

1.     將過夜成長之無Plasmid菌液, 以1:5稀釋於LB液中, 使在37℃, 300rpm振盪培養箱中長1hr.

2.     15ml上述菌液, 放入一離心管中, 加入等量之2X TSS, 緩緩混合, 置冰上5min.

3.     離心4,000rpm, 5min倒去上清, 再加入3ml之1X TSS (以2XTSS 加消毒過之dH2O而成), 使細菌溶解.

4.     100μl之細菌, 加5μl之質體DNA(大約1~100μg DNA即可), 充分混合(在一個1.5ml的離心管中), 置冰上10min.

5.     加入0.9ml LB液(內含20mM glucose), 置37℃, 30min, 每隔3min混合一次, 在以稀釋塗平盤法, 將細菌塗在含IPTG, X-Gal, 及抗生素的平盤上.

6.     另取為未經轉植的細菌(即步驟4時, 100μl菌加5μl之T.E.不含質體), 亦稀釋塗平盤為對照組.

預期結果:大約107CFU/μg DNA結果可由此方法達到.

五、噬菌體(Bacteriophages)

    λ(Lambda), 可作為嫁接媒介(Cloning Vector), 因其基因中的一段與它的繁殖無重要關係, 可被刪除, 而可接入其他基因. 但λ的基因若比野生種多(超過105﹪)或少(不及78﹪)就會影響此DNA不會被包入噬菌體之殼內.

    將λ的基因與質體複製點及可選擇標誌結合, 成為comid的λ phage可侵附宿主, 並將DNA注入宿主, 而注入的DNA是質體, 因為它兩端含有λ phage的cos區域DNA排序, 會使此直鏈狀DNA形成環狀質體(加上宿主DNA ligase 的協助). 如此, 此cosmid就以質體形式在宿主中繁殖.

 

    :λ噬菌體計數與純化

   

LB (內含0.2﹪W/V maltose及10mM MgSO4), 洋菜平盤及軟洋菜覆蓋層(每支試管中3ml)

稀釋液(Suspension medium SM) (裝在13×100mm試管中每支4.9ml)

[配方]每公升含:5.8g NaCl              2g MgSO4.7H2O

50ml 1M Tris.Cl,pH7.5     0.01﹪ gelatin

55℃水浴器

微波爐

   

1.     E.Coli培養於含0.2﹪(w/v)maltose及10mM Mg4SO液中, 因maltose可誘使E.Coli多生λ receptor(lamB protein), 此receptor亦具傳輸maltose功能, Mg++離子亦有助l附著.

2.     將軟洋菜覆蓋層試管放入微波爐中使沸, 將以融化之軟洋菜試管放入55℃水浴器中. (注意:試管蓋必須鬆開才能放入微波爐中)

3.     4.9ml之SM液管做λ的稀釋, 逐次稀釋4次.

4.     將每次稀釋的λ, 各取0.1ml(每次稀釋做二個重複), 加入一支含3ml軟洋菜的試管中, 編上記號.

5.     在各含稀釋λ及軟洋菜的試管中, 加入0.5ml之E.Coli緩緩混合, 置55℃, 3min.

6.     將含軟洋菜, E.Coli及λ phage的各支試管分別倒入洋菜平盤中, 使均勻分布, 待冷卻後, 將平盤倒置, 標示於底部, 並將平盤放37℃培養箱內, 待第二日計算Plaque forming unit/ml(PFU/ml).

7.     若要取得純λ phage, 只需以消毒過之牙籤沾取單獨一個plaque, 在放入SM液中, 使λ phage可保存在-70℃. 將來要長λ phage, 只要由此保存液中吸取部分, 加入E.Coli菌液中培養, 待E.Coli被破壞, λ phage量就增加, 一般可達1011PFU/ml.

 

    :λ phage成長曲線

    應用phage計數同樣的方法, 只是在開始時, 另備一E.Coli菌液, 在O time時加入定量之λ phage, 然後每隔20min計數一次, 計120分鐘.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

..DNA量的測定

   

T.E. buffer

光譜儀(可測250~300nm光譜)

可透過紫外線之微量cuvette

待測DNA

   

1.     先將光譜儀溫機(warm up).

2.     T.E. buffer為標準液, 測定標準液.

3.     1:50稀釋待測DNA於TE中, 再測其250~300nm之吸收光譜, 最主要要求得260nm及280nm之值.

4.     260nm之吸收值/280nm之吸收值, 若>1.7, 則DNA較純;若<1.5則可再用前述DNA純化法再加以純化. 若所得之值>1.7, 則用在260nm時之吸收值乘以50μg/ml, 再乘以稀釋係數50, 所得之值即為每ml中DNA之含量.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

..濃縮DNA的方法

    若所得之DNA純度夠, 但濃度不足, 可以下法加以濃縮(主要想將DNA液中之水分去掉).

 

   

待濃縮之DNA

sec-butanol(2-butanol)

T.E. buffer

diethyl ether

   

1.     將待濃縮DNA亦與等體積之sec-butanol加入, 充分混合.

2.     室溫, 離心2,500rpm, 5min.

3.     倒去上清(上清為含水之sec-butanol), 必要時可重複此一程序, 使水份充分脫除.

4.     適當等量之diethyl ether與TE buffer 充分混合, 置室溫一分鐘, 待分為二層, 上曾為ether, 將此上層ether液取與濃縮後之DNA等量, 加入濃縮漏之DNA液中, 充分混合.

5.     置室溫2分鐘, 待分為二層, 上層為ether, 可將上層吸除.

6.     殘存之ether可將管蓋打開約15分鐘, 待其自然揮發.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

、抽提動物細胞的DNA

   

液態氮

Digestion buffer

[配方]100mM NaCl          10mM Tris.Cl,pH8

25mM EDTA, pH8      0.5﹪sodium dodecyl sulfate

      0.1mglml proteinase K(proteinase K必須在每次使用前才加入以保有效)

4℃ Phosphate-buffered saline (PBS)

[配方]10X儲存液:

每公升中含--80g NaCl              2g KCl

11.5g Na2HPO4.7H2O     2g KH2PO4

使用液(工作液):

pH7.3--137mM NaCl       2.7mM KCl

4.3mM Na2HPO4.7H2O       1.4mM KH2PO4

25:24:1 Phenol/Chloroform/isoamyl alcohol

7.5M ammonium acetate

100﹪及70﹪ethanol

TE brffer pH8

   

1.     將動物組織切下, 迅速放入液態氮中, 待組織凍硬, 立即磨成粉狀.

2.     100mg組織加入1.2ml digestion buffer. (若係用組織培養細胞, 則離心1000rpm, 5min, 沉澱細胞, 再以PBS洗細胞二次, 離心除去PBS, 再將細胞溶在digestion buffer中, buffer的用量為每108細胞用1ml).

3.     將組織或細胞放在digestion buffer中, 在50℃, 振盪12hr.

4.     以等體積的Phenol/Chloroform/isoamyl alcohol提取DNA.

5.     離心2,500rpm, 10min, 上清液中為DNA. (若中間層的白色物質量多, 可重複此提純程序)

6.     將上清一轉至另一離心管中, 加入1/2倍體積量之7.5M ammonium acetate, 及上清液量2倍之100﹪ethanol, DNA當很快析出. 再以離心2,500rpm, 2min, 沉澱DNA, 倒去上清.

7.     70﹪ethanol洗DNA, 以去除鹽分及phenol, 倒去酒精, 使DNA乾燥.

8.     DNA溶入適量TE中, 可將離心管放65℃並緩緩振盪, 以加速溶解.

9.     DNA保存在-20℃(以1mg/ml為佳).

預期結果:每克動物組織或每109個細胞約可得2mg DNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.九. 使用NucleoSpin Tissue提純組織, 細胞或細菌或犯罪現場之DNA

注意:

1.     先將Buffer 5瓶(有2瓶, 各7ml, 先準備1瓶, 用完再準備另1瓶)中, 加入28ml的99﹪酒精, 及Proteinase K瓶中加入1.35ml dH2O, 將調好的Proteinase K分為100μl/支, 標示後, 保存於-20℃. 使用時取1支使用.

2.     Buffers B1, B3, (B3為B1與B2的等量混合) BW中含granidinium hydrochloride, 使用時須戴手套.

3.     buffer中有沈澱可置56℃處理.

4.     先設定2個water bathes, 一為70℃, 一為56℃.

步驟:

1.     25mg動物組織, 置入1.5ml離心管, 加入75μl phosphate buffered saline(PBS), 磨碎;

*若為細菌, 用1ml菌液, 離心7,500rpm, 5min, 吸除上清, 將細菌溶於170μl之20mM Tris/Cl, 2mM EDTA, 1﹪Triton, 20mg/ml lysozyme pH8之液中1hr, 再進行加25μl proteinase K, vortex 20sec, 及其後步驟.

*若為乾血漬, 以刀片切下含血漬物約15-30mm2, 置入1.5ml離心管, 加入180μl T1, vortex 30sec, 置94℃, 10min, 加入25μl proteinase K,vortex 30sec, 置56℃, 1hr, 每10min, 取出vortex 20sec,  加入200μl B3,  vortex 30sec, 置56℃, 10min, 再進行由第5步驟以下步驟.

*若為髮根, 在1.5ml離心管中, 將100支髮根加入180μl T1液, 置液態氮中, 再取出置56℃, 1min, 如此反覆4次. 加入25μl proteinase K, vortex 20sec, 置56℃, 隔夜, 再進行步驟4.

*若為糞便, 取250mg糞便溶於1ml TE中(10mM Tris/Cl, 1mM EDTA, pH=8,) vortex 30sec, 離心5,000rpm, 15min, 吸除上清, 將沈澱物溶於1ml T1中, vortex 15sec, 立即吸上層液200μl入1新離心管, 接著做步驟2.

*若為血液, 取200μl全血液或buffy coat, 加入25μl proteinase K液, 加入200μl B3, vortex 15sec, 置70℃, 15min, 加入210μl, 99﹪酒精, vortex 15sec, 將所有液體吸入套好的NucleoSpin column中, 離心13,000rpm, 1min倒去液體, 再加入500μl BW, 離心13,000rpm, 1min, 倒去液體, 再加入600μl B5, 離心13,000rpm, 1min, 倒去液體, 再離心13,000rpm, 1min, 倒去液體, 將NucleoSpin column重裝在1支新離心管中, 加入已預熱至70℃的BE液100μl, 置室溫2min, 離心13,000rpm, 2min, 即得DNA.

*若為組織培養之動物細胞, 以離心1,000rpm, 4min, 沈澱取得5×106細胞, 加入180μl T1及25μl proteinase K, vortex 15min, 再置56 ℃, 10min, 加入200μl B3, 210μl酒精, vortex 20sec, 再接第6步驟.

2.     加入180μl T1及25μl proteinase K, vortex 20sec.

3.     56℃ 1hr, 每10min vortex 1次, 15sec, (必要時可另購RNase加入)

4.     vortex 20sec, 加入200μl B3, vortex 20sec, 置70℃, 10min.

5.     加入210μl 酒精, vortex 20sec.

6.     裝妥1組NucleoSpin套組, 將液體吸入, 離心10,000rpm, 2min, 倒去液體, 重裝妥NucleoSpin套組.

7.     加入500μl BW, 離心10,000rpm, 1min, 倒去液體, 重裝妥NucleoSpin套組.

8.     加入600μl B5, 離心10,000rpm, 1min, 倒去液體, 重裝妥NucleoSpin 套組.

9.     離心13,000rpm, 3min, 倒去液體, 重裝妥NucleoSpin套組於1支新的1.5ml離心管中.

10.加入200μl預熱至70℃的BE buffer, 置室溫2min, 離心13,000rpm, 1min, 所得即DNA.

    若所得DNA之A260/280<1.6, 可加入等量(1volume)B3及等量99﹪alcohol, vortex 10sec, 再將液體吸入NucleoSpin 套組中, 離心13,000rpm, 1min, 倒去液體, 再加入500μl BW液, 離心10,000rpm, 1min, 倒去液體, 再加入600μl B5液, 離心10,000rpm, 1min, 倒去液體, 再離心 13,000rpm, 3min, 重裝妥NucleoSpin套組於1支新的1.5ml離心管中, 加入200μl預熱至70℃的BE buffer, 置室溫2min, 離心13,000rpm, 1min, 所得即DNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十.使用Coulter Counter Z1方法

    使用前先將Diluent 瓶裝入IsotonII至少半瓶, 將Waste瓶倒空. 將測試杯裝滿Isoton置樣品台, 擡高樣品台, 使測試管及電杯泡在Isoton內.

1.     打開電源, 按Function鍵, (用<, >來選所要的項目, 選定後按Start/Stop鍵即可), 先選Fill System, 按Start, 再按1次Start. 機器即開始抽Isoton入管12次. 待完成後;

2.     set-up, 確認aperture為100μm, Kd=60, select Units為μm, lower size=2.0μm, volume=0.5ml, 再按set-up, 機器會調整設定之參數, 再按set-up, 看設定值對否, 對, 則再按set-up, 此時機器會列出完整參數, 可用<, >來選, 選好按Start, 即開始計數.

3.     使用完, 將Coulter Cleanz液裝入測試杯, 按Prime, 機器會清洗管子8次, 再換dH2O裝入測試杯, 按Prime, 機器會再清洗管子8次, 然後關機.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

十一、抽提植物細胞的DNA(方法一)

   

消毒過之dH2O, 4℃

液態氮

Extraction buffer

[配方]100mM Tris.Cl, pH8      100mM EDTA

250mM NaCl              100μg/ml proteinase K

10﹪(W/V)  N-lauroyl sracosine (SarKosyl)

100﹪及70﹪ethanol

TE buffer

7.5M ammonium acetate

方 法 一

1.     取幼嫩植物組織10~30g, 以dH2O清洗, 晾乾.

2.     以液態氮將植物組織冷凍, 磨成粉.

3.     將粉裝入離心管, 加入extraction buffer (每克植物組織加10ml extraction buffer), 充分混合. 再加入適量之10﹪SarKosyl使最終濃度成為1﹪.

4.     55℃, 1hr.

5.     離心10min, 6,000rpm, 4℃, 保留上清, 至另一離心管中.

6.     加入上清液0.6倍的isopropanol緩緩混合. DNA應即析出,  否則置-20℃, 30min.

7.     離心8,000rpm, 4℃, 15min, 倒去上清. 再將DNA溶於適量TE中.

8.     接下來可用純化DNA的方法純化DNA (即25:24:1之Phenol/Chloroform/isoamyl alcohol)等量混合, 離心2,800rpm, 10min, 上清液中為DNA.

9.     將上清液轉至另一離心管中, 加入1/2倍體積量之7.5M ammonium acetate, 以及上清液量2倍之100﹪ethanol, 析出DNA. 再以2,800, 2min, 離心, 沉澱DNA, 倒去上清.

10.70﹪ethanol洗DNA, 以去除鹽分即phenol, 倒去酒精, 將DNA溶於適量TE中.

11.DNA保存在-20℃.

用此法所得之DNA會含有粒腺體及葉綠體中的DNA, 要想得到純植物DNA, 要用超高速離心機分離.

以此法所得之DNA量, 大約是每克植物10至40μg DNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

十二、抽提植物細胞的DNA(方法二)

1.     25g植物幼葉洗淨, 置研缽中, 加入25ml檸檬酸納液(配方:每公升dH2O中加8.18g Na citrate高溫高壓消毒), 研磨成泥狀.

2.     加入150ml均質化液(Homogenization Solution) (配方:每公升dH2O中加Na lauryl sulfate 100.0g, Na citrate 2.94g, NaCl 8.18g, 高溫高壓消毒), 再繼續研磨30min, 將此泥狀液以雙層紗布過濾, 並擠出紗布上的液體.

3.     將液體適量均分置離心管, 分別加入2倍體積的99﹪酒精, 離心200xg, 5min, (4℃), 倒去上清, 此沉澱中含細胞核, 加入原液體積1.5倍量的NaCl液  (配方:每公升dH2O中加NaCl 81.8, 高溫高壓消毒), 充分混合, 離心10,000xg, 25min, 20℃, 將上清液倒入一清潔無菌小燒杯, 保留.

4.     再加入15ml NaCl液至離心管中, 充分混合, 再離心10,000xg, 25min,    20℃.

5.     將上清液倒入前已有上清液倒入的同一清潔無菌小燒杯中, 緩緩加入等體積的99﹪酒精, 並以玻棒攪拌, 此時DNA會繞再玻棒上, 繼續攪拌, 至DNA不再繞在玻棒上.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

十三、細菌DNA的抽提

使用Quantum Prep AquaPure Genomeic DNA Kit萃取細菌DNA

1.     E.coli overnight culture 500μl, 置入1.5ml離心管, 置冰上, 離心10,000rpm 15sec, 吸除上清液, 再加入300μl genomic lysis buffer, 使細菌充份溶解, 置80℃水浴或hotblock上, 5min.

2.     將上述離心管置室溫5min, 加入1.5μl RNase solution,充份混合,置37℃, 45min, 再將上述離心管置室溫5min, 再加入100μl protein precipitation solution, vortex 30sec, 離心11,000rpm, 3min.

3.     保留上清液於另一個1.5ml離心管中, 加入300μl 100﹪isopropanol, 充份混合, 離心13,000rpm, 2min, 倒去上清, 以300μl 70﹪酒精緩洗沈澱之DNA, 離心13,000rpm, 1min, 倒去上清, 瀝乾.

4.     加入50~100μl DNA hydration buffer, 置65℃水浴或hotblock上, 5~30min. 使DNA充分溶解. 保存於-20℃.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十四.植物組織培養與生物技術

    將欲做組織培養的植物清洗乾淨, 再浸入70﹪酒精20秒,再浸入含0.05﹪Tween 20或Triton-100的0.25﹪漂白水(NaOCl), 或3﹪H2O2, 或1﹪AgNO3中20min,(可置於超音波槽中處理). 再以無菌蒸餾水浸洗3次, 每次5min.

*以紅羅葡為例:

將紅羅葡外表洗清後, 以無菌解剖刀, 切出一薄圓塊, 再以上述步驟消毒後, 再切出1小塊形成層(cambium)部份, 此小塊可再分切為多塊, 分置無菌且含癒傷組織誘發液(Callus-induction medium) (配方:1x Murashige and Skoog medium[MS medium] 1公升, 2,4-D 1.0mg, pH=5.5[用0.1M NaOH調]), 若要固態則加入8.0g agar, 高溫高壓消毒)的無菌有蓋試管中, 培養液不超過小塊表面, 置室溫, 日光燈下, 約4週, 可見癒傷組織.

以玉米胚為例:

先將玉米粒以前逑方式消毒, 再置無菌培養皿中, 置室溫暗處, 以無菌蒸餾水浸1日, 第2日, 以無菌解剖刀, 將胚以外部份切除, 將胚轉移至含胚培養基(Embryo Culture Medium)平盤中 (配方:1x MS medium 1公升,  pH=5.5[用0.1M NaOH調]), 若要固態則加入8.0g agar, 高溫高壓消毒, 待溫度降至50℃左右倒平盤). 平盤周圍以parafilm封好, 置室溫暗處. 在1週內可見根, 莖, 長出.

以扶桑葉為例:

取幼扶桑葉, 以前逑方式消毒, 再取中間有葉脈部份, 切成1cm2小塊, 置入含微量繁殖液(Micropropagation Medium)(配方:1x MS medium 1公升, Indolebutyric acid [IBA] 1.0 mg, Benzylaminopurine[BAP] 3.0 mg, pH = 5.5[用0.1M NaOH調], 若要固態則加入8.0g agar, 高溫高壓消毒, 待溫度降至50℃左右倒入廣口錐瓶中), 蓋好, 置室溫日光燈下, 約6週, 可見根, 莖, 長出.

 

 

 

 

 

 

.十五.植物原生質體(protoplast)分離與處理

植物原生質體是不具細胞壁的植物細胞.

以杜鵑花為例:

取杜鵑花依前逑法消毒後, 切成約1mm寬條狀, 置無菌培養皿中含10ml細胞壁裂解液(Cell Wall Lysis Solution)(配方:每100ml蒸餾水中含cellulase 2.0g, mannitol 10.27g, [先溶mannitol], 再以過濾法消毒), 置室溫微光下1日. 第2日,可將培養皿置解剖顯微鏡下,以無菌吸管將原生質體吸出另行培養於MS液中,再取少許以0.3﹪trypan blue染色, 在普通顯微鏡下觀察, 活細胞會排除trypan blue, 死細胞不會.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十六.白血球染色體的分離

1.     抽血5ml入含抗凝血劑的試管中, 離心2,500rpm, 10min, 以微量吸管吸取白血球層, 置入1.5ml離心管中. 加入600μl red blood cell lysis buffer, 先充份混合後, 再置平臺頃斜器上緩緩混合5min, 離心3,000rpm, 5min, 吸除紅色上清液.

2.     1ml已經高溫高壓消毒過且已加入5﹪牛血清及含2×10-3mM L-glutamine的MEM組織培養液加入上述離心管中, 充份混合, 將此含白血球的培養液全部吸出, 置入25cm2的組織培養皿中, 再加入4ml的上述MEM組織培養液, 再加入無菌秋水仙素(colcemid),使最終濃度為10-2μM, 將組織培養皿置含5﹪CO2組織培養箱中, 2hr.

3.     將上述培養液全部倒入40ml離心管, 離心5,000rpm, 5min, 倒去上清, 加入低張溶液(配方:0.075M KCl)3ml, 充份混合, 置37℃, 20min, 再加入固定液(配方:甲醇:冰醋酸=3:1)6ml, 緩緩充份混合, 離心5,000rpm, 5min, 倒去上清, 再加入5ml之固定液, 緩緩充份混合, 離心5,000rpm, 5min, 倒去上清, 再加入5ml之固定液, 緩緩充份混合, 離心5,000rpm, 5min, 倒去上清, 將白血球液溶在1ml的固定液中.

4.     將清潔載玻片置酒精中浸泡, 取出, 將上述白血球液滴1~2滴於載玻片上, 使其風乾, 滴上Giemsa染色. 在顯微鏡下400x攝影.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十七.動物組織培養技術

在做白血球染色體時已大致介紹過:

1.     MEM動物組織培養液的配製:依廠商說明之濃度, 將可高溫高壓消毒的MEM加入應有總量90﹪的dH2O, 然後高溫高壓消毒, 待冷卻後加入10﹪牛血清, 及最終濃度2×10-3mM的L-glutamine. (若係維持液, 牛血清量可酌減).

2.     Animal cell lines可向新竹食科所採購.

3.     CO2培養箱內底層應加水內置少量CuSO4防黴, 保濕.

4.     經常以倒置式顯微鏡查看細胞狀況.

5.     當細胞擁擠, 吸除培養液, 以生理食鹽水洗細胞2次, (以25cm2培養皿言)加入1ml的0.25﹪trypsin-EDTA液, 使勻佈15sec, 吸除, 再等1min, 加入2ml培養液將細胞溶入, 然後吸除2/3, 保留1/3, 再加入4.3ml培養液, 即可.

6.     對動物細胞的保存, 可將細胞以trypsin-EDTA液取出, 離心3,000rpm, 5min, 倒去上清, 以適量生理食鹽水洗細胞1次(離心洗), 將細胞以最終濃度2×107/ml溶於含8﹪DMSO的培養液中,保存於小型膠管中,置4℃, 1hr, 0℃, 1hr, -20℃, 1hr, 再置-70℃, 保存.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十八.使用NucleoSpin RNA II 套組萃取RNA

注意:

1.    在使用此套組時, 必須戴手套, 因其中含guanidinium thiocyanate.

2.    此套組中之乾粉狀RNase-free DNase I 必須存於-20℃. 在使用前加入指定量之RNase-free water,再以每100μl保存在小離心管中,存於-20℃.

步驟:

1.    106動物細胞, (或0.1g動植物細胞), 加入液態氮及400μl RA1液及4μlβ-mercaptoethanol以研砵磨碎, 將碎液吸入NucleoSpin Filter中套上外管, 以13,000rpm離心1min.

2.    在保存之液體中, 加入300μl之99﹪ethanol, vortex.

3.    2之液體吸入NucleoSpin RNA column中, 離心10,000rpm, 30秒. 將外管丟棄, 換一新外管, 再離心13,000rpm, 1min.

4.    此時準備DNase reaction mixture, 將已液化之DNase1 取10μl, 加90μl DNase 1 reaction buffer, 將此混合液吸入3之內管中, 置室溫15min.

5.    500μl RA2入3之內管中, 離心30sec, 10,000rpm. 將內管取出換置入另一新外管中, 吸600μl RA3入3之內管中, 離心30sec, 10,000rpm, 倒去外管中液體, 再套好外管, 吸250μl RA3入3之內管中, 離心2min, 13,000rpm, 使內管完全乾, (若液面接觸內管中之膜層, 須倒去再離心), 再將內管取出置入另1nuclease-free新外管中.

6.    100μl RNase-free water入內管, 離心13,000rpm, 1min, 所得即RNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.十九.使用NucleoTrap mRNA套組 分離mRNA

注意:

1.     緩衝液中含LiCl, 必戴手套.

2.     此套組中之oligo dT粒子液, 每20μl=1mg, 可吸附5μg的mRNA.

步驟:

1.     若係乾燥之RNA, 則加入1,000μl RM1 binding buffer (可適用於100~1,000μg之RNA量), vortex使RNA充分混合. 若係液態RNA(溶於水中, TE中或其他常用之緩衝液中均適用), 取200~500μl之RNA液, 加入等量之RM0 binding buffer, 充分混合.

2.     Olig dT粒子均勻化(vortex), 在每含100μg之RNA中加入15μl的Olig dT粒子, 充分混合, 置68℃ 5min(使RNA的2次結構去除), 再置室溫10min, 每2min混合幾下.

3.     離心15sec, 5,000rpm, 再離心5min, 13,000rpm, 吸除上清液, 加入600μl washing buffer RM2, 吸上吸下充分混合.

4.     Olig dT粒子液吸入NucleoSpin microfilter離心15sec, 5,000rpm, 再離心2min, 10,000rpm. 倒去液體.

5.     加入500μl washing buffer RM3於NucleoSpin microfilter中, 並小心不弄破NucleoSpin microfilter而將Olig dT粒子充分混合.

6.     離心15sec, 5,000rpm, 再離心2min, 10,000rpm. 倒去液體(去除rRNA).

7.     再加入500μl washing buffer RM3於NucleoSpin microfilter中, 並小心不弄破NucleoSpin microfilter而將Olig dT粒子充分混合. 離心15sec, 5,000rpm, 再離心2min, 10,000rpm. 倒去液體(再次去除rRNA).

8.     再離心1min, 13,000rpm, 以乾燥NucleoSpin microfilter. 將NucleoSpin microfilter管取出置於另1RNase-free離心管中.

9.     對最初加入每10μl的Olig dT粒子液, 加入20μl已加熱至68℃的RNase-free water, 吸上吸下, 充分混合, 置68℃, 7min, 離心1min, 13,000rpm. 所得液體即mRNA. 可再吸入原最初加入每10μl的Olig dT粒子液, 加入10μl已加熱至68℃的RNase-free water, 吸上吸下, 充分混合, 置68℃, 7min, 離心1min, 13,000rpm. 此第2次所得之mRNA濃度將較低(約第1次的10~20﹪). 可分別保存在-70℃.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.二十.將mRNA製為cDNA的方法

1.     準備2.5mM的dNTPmix與5x Reverse Transcriptase (RT) buffer(含250mM Tris-Cl, pH8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2), RT 200μg/μl, 0.1M DTT(通常隨買RT並附), 10x Taq polymerase buffer.

2.     PCR用0.5ml離心管, 準備mRNA, (最好1μg/μl), 10μl, 加入1μl(0.1μg/μl)工random primer(6-mer), 置70℃, 2min.

3.     加入5x RT buffer 5μl,  0.1M DTT 3.5μl,  dNTPmix 5μl,  RT 1μl, 置37℃1hr.

4.     70℃, 5min, 使RT破壞.

5.     2.5μl出來用置入另1PCR用0.5ml離心管, 加入8μl dNTPmix, 10μl Taq polymerase buffer, 加入針對此基因設計的2個primers各1μl, 加入1μl Taq polymerase,  再加入dH2O 77μl,  再加50μl mineral oil,  執行PCR, 94℃, 5min, 94℃, 1min, 55℃, 1min, 72℃, 2min, 30cycles, 即成. 所得成品可以電泳純化.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二十一、DNA電泳分析

   

電泳緩衝液(可用TAE或TBE), 配方如下:

TAE-儲存液:50X, 每公升中含:242g Tris. Base

57.1ml glacial acetic acid

37.2g Na2EDTA. 2H2O

pH8.5

使用液:0.04M Tris. Acetate

0.002M EDTA

TBE-儲存液:10X, 每公升中含:108g Tris. Base

55g boric acid

40ml 0.5M EDTA

pH8.0

使用液:0.089M Tris. Base

0.089M boric acid

Ethidium bromide solution

[配方]1000X儲存液(0.5mg/ml)

50mg ethidium bromide

100ml H2O

保存在4℃, 不透光瓶中.

使用液:0.5μg/ml

將儲存液以1:1000倍稀釋作用

Agarose

10X loading buffer

[配方] 20﹪Ficoll 400

0.1M Na2EDTA, pH8

0.1﹪ Sodium dodecyl sulfate

0.25﹪ Bromphenol blue

0.25﹪ Xylene Cyanol

其中Xylene Cyanol 在電泳時, 比Bromphenol blue跑得慢50﹪左右.

DNA分子量marker(可依電泳之DNA分子大小選擇適當之marker)

電泳設備及供電設備

紫外線手提光源, 紫外線光源平台, 拍立得相機(專供照電泳結果用)及橘色濾光鏡.

   

1.     TAE或TBE準備電泳膠, 在膠內加入ethidium bromide(最終濃度0.5μg/ml)泳膠中agarose的成分依DNA的大小而不同, 以直線型DNA為例可參考下表:

Agarose的成分量

DNA(直線型)長度Kb

0.5

1~30

0.7

0.8~12

1.0

0.5~10

1.2

0.4~7

1.5

0.2~3

    所倒的泳膠厚度約在0.5~1cm之間, 泳膠可在微波爐中加熱融化, 待其冷卻至手觸仍感燙但不過燙的程度, 即可倒入泳膠盤中, 插好泳膠盤梳, 待其冷卻, 再抽出梳子.

2.     將泳膠放入電泳裝置中, 加入適量電泳緩衝液, (液面大約高出膠面1mm即可).

3.     DNA樣本適量加入適量10X loading buffer後, 以micropipet轉入膠孔中.

4.     通上電流, 電流以泳膠之長度每cm 10V為原則.

5.     loading buffer之藍色移至相當位置後, 即可將電流關掉, 檢查電泳結果, 或將結果攝影. 電泳結果可以手提式紫外線光源照射觀察, 亦可用有罩式拍立得相機(必須加裝橘色濾光鏡), 在紫外線光源平台上攝影. 底片使用Polaroid編號667(ASA3000).

 

 

 

 

二十二、由電泳膠中提取DNA

    本實驗採用GENECLEAN III Kit,此套實習材, 保存於室溫, 約有80﹪的DNA回收率.

   

NaI液

New Wash濃縮液

TBE modifier

GCIII Elution Solution

其中NaI為6M sodium iodide solution

TBE modifier是用於泳膠, 若是以TBE與Agarose製成, 則加切下泳膠體積1/2之TBE modifier及4.5倍體積的NaI.

EZ-GLASSMILK是溶於dH2O的浮懸液, 沉澱下來, 應沉澱與水各半, 若水分蒸散, 可加入適當dH2O.

New Wash solution之配置:用14ml之濃縮液, 加280ml dH2O, 在與310ml 100﹪ethanol(或95﹪ethanol)混合. 用此套實習材將DNA游泳膠中提出後, 不含ethidium bromide.

因為TBE對DNA粘附在EZ-GLASSMILK上有影響, 故在將泳膠加入NaI融化前先加入TBE modifier以去除此影響(降低pH).

   

1.     以小刀片將含DNA的泳膠切出(在紫外線平台上執行), 秤重量, 以重量估算體積, 大約1g為1ml, 將此小塊泳膠放入1.5ml離心管中(切塊最好在0.4g以下).

2.     若電泳是在TAE中執行者, 則不用加TBE modifier, 直接加入3倍體機的NaI液, 若電泳在TBE中執行者, 則先加入1/2倍體積之NaI液. 將離心管置55℃水浴器中, 每隔一分鐘取出混合一下, 再放入, 約5分鐘泳膠可完全融化.

[此套實習材也可用在為提純DNA, 即將DNA液中直接加入3倍體積的NaI液, 然後進行下列步驟].

1.     加入適量之EZ-GLASSMILK, 加入之量以預估DNA含量有關, 即每1μg DNA要加2μl, 但最初至少要加5μl, 亦即若DNA含量少5μg, 亦至少要加5μl;若多於5μg, 再每多1μg, 加2μl.

2.     充分混合, 並置室溫5min, 每1分鐘混合一下.

3.     離心2,500rpm, 10sec.

4.     吸除上清液, 加入400μl之New Wsah液, 充分混合, 再離心2,500rpm, 10sec, 吸除上清, 如此再重複2次(共洗3次), 吸除上清.

5.     加入20μl之GCIII Elution Solution, 充分混合, 離心3,000rpm, 30sec, 吸取上清, 即為所要之DNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二十三、限制酶切割DNA技術

   

dH2O

10X restriction endonuclease buffer (採購限制時同時向廠商索取)

Gel loading buffer (通常亦隨限制酶同時附贈)

   

1.     將下列材料以micropipettor吸取放入一個1.5ml的離心管中:

Xul DNA (DNA的量應再0.1~0.4μg之間, 溶於dH2O或TE中)

2μl 10X restriction buffer

18-Xμl dH2O

2.     加入restriction endonuclease(每μg DNA 1~5 unit, 每unit 表示限制酶再1hr中可完全切割1μ DNA的限制酶量), 至37℃, 1hr.

3.     加入5μl gel loading buffer.

4.     DNA電泳程序以電泳檢測結果.

    若是DNA要以一個以上的酶切割, 可視各酶條件, 若條件相若, 可同時加入;若條件不同如溫度, 鹽分等要求. 可分別切割, 先切割溫度要求低的, 鹽分要求低的, 再加入鹽分(如1μl的1M NaCl), 或提高溫度.

    若是用同一個酶同時切割許多DNA標本, 可先將10X restriction endonuclease buffer, dH2O, restriction engonuclease置在另一個離心管中依總需要量混合好, 再分別吸入不同DNA標本管中, 待切割時間到, 再加入gel loading buffer, 再進行電泳.

    下列為常用限制酶與其切割排序, ↑表示切割位置:

酶 名 稱

切割片段與位置

    

Asp I

5'GACN↓NNGTC3'

(N代表可為A, T, G, C,中任一)

Bam HI

G↓GATCC

(與Bst I同)

EcoR I

G↓AATTC

 

Hind III

A↓AGCTT

(與Hinc II同)

Hpa I

GTT↓AAC

 

Ksp I

CCGC↓GG

(與Mra I, Sac II, Sst I同)

Pac I

TTAAT↓G

 

Pst I

CTGCA↓G

 

Sac I

GAGCT↓C

(與Sst I 同)

Taf I

T.↓CGA

(與Teh HB 81同)

以上的切割位置均為雙股, 故雙股的切割位置以Bam HI為例為:

5'G↓GATCC3'

3'C CTAG↓G5'

其餘均類此.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二十四、用於修飾DNA的酶與使用方法

    酶應保存在-20℃冷櫃中, 使用時取出放在0℃冰上, 酶的價格昂貴, 宜珍惜使用.

    各種酶均有其特別的緩衝液. 通常均可在採購時向廠商索取.

    The Klenow fragment:是E.Coli DNA PolymeraseI靠C端的部份,為刪去由NH2端的323個胺基酸而成,具有DNA Polymerase與3'→5'exonuclease的功能. 以Klenow fragment來將含螢光標定的d NTP或放射性標定的d NTP加於DNA片段尾端, 可將約0.1~4μg由電泳中提純的DNA, 加上螢光標定的d NTP, 再加上未標定的3 d NTPs, 再加上1U的Klenow fragment, 再加入適量buffer, 置30℃, 20min即可(其中d NTP的濃度在0.5mM). 此原理是利用限制酶切割後再經電泳提純的DNA, 在二端均有 ----____單股部分, Klenow fragment會將d NTP加於單股處, 此時需注意的是所缺的單股若正好無可配標定d NTP的核甘酸則無法標定, 故應注意. 如以Ban HI切割的會有GATC排序, 若以Eco RI切割的則會有AATT排序, 此時若以有標定的GTP或CTP來標定則無效.

    亦可採用Random Oligonucleotide-Primed synthesis方法來標定DNA, 其原理為:將DNA以某一限制酶切割, 再電泳, 取出所需的DNA片段, 加熱使此雙股DNA分為單股, 再將Random Oligonucleotide(通常為六個nucleotides)接上去, 再放入d NTPs即Klenow frament, 如此, 則DNA片段就會被標定了.

   

1.     在一個小型離心管中加入2.5μl之0.5mM 3dCTPs.

2.     再加入10X之Klenow fragment buffer, 2.5μl.

3.     加入欲標定之有標定dNTP, 1μl.

4.     再加入1μl之Klenow fragment.

5.     再以另一支離心管, 加入約0.03~0.1μg的DNA(想被標定的DNA), 及Random hexanucleotide(1μg), 再加入T.E. buffer使總體機為18μl, 將此離心管置沸水中3min, 再取出放冰上.

6.     將二支離心管物混合, 置室溫, 3hr, 反應即完成.

 

Taq DNA Polymerase之使用

    酶係由Thermus aquaticus菌所分離出來, 它的最有效溫度是在75~80℃, 它多被用於Polymerase Chain Reaction(PCR). 其使用方法在介紹PCR時再行介紹.

    RNase亦有由不同來源分離出來者, 所切割RNA的位置亦不同, 但一般RNase均能在多種反應情況下產生作用, 且使用後若要除去它, 通常要加入Proteinase K, 再以Phenol extractions及ethanol precipitation處理.

DNA ligases

    用以接合單股有缺口的DNA或雙股可交叉配合的DNA(即以限制酶切割所形成的 ----____ 交叉片段. 時下使用的ligase, 要ATP, E.Coli ligase要NAD為能源.

使用方法

1.     在微量離心管中加入ligase緩衝液,再加入0.5mM ATP, 1μg DNA(即所需接合的DNA), 再加入1μT4 ligase, 置15℃, 2hr, 可成.

2.     若係二段鈍端DNA接合(即無交叉片段之DNA), 則需10倍以上的酶方能達成. 有研究顯示加入即為量的PEG8000可助ligase的功能.

運用ligase構建嫁接DNA分子

1.     再將想構建的DNA片段經電泳幼提純之後, 以下法進行:

2.     0.1至5μg想接合構建的DNA放入微量離心管中(體積以9μl為準), 再加入10μl之2X ligase buffer, 再加入1μl之10mM ATP, 再加入20至500μT4 DNA ligase(以有交叉配對的DNA為準).

3.     15℃, 3hr, 或隔夜, 可成.

4.     將此接合之嫁接媒介, 以基因轉植方式, 植入E.Coli宿主, 並檢查結果, 依marker表現情形可知有無正確的結果, 若有, 則將含此正確嫁接媒介的E.Coli加以培養, 再以提純質體方式獲取大量所要的嫁接媒介.

 

2X T4 DNA ligase buffer之配方為

100mM Tris.Cl, pH7.5

 20Mm MgCl2

 20Mm DTT(dithiothreitol此物必須冷凍保存)

    在構建嫁接媒介時, 必須考慮到它要能在宿主中能自行複製, 且能將所要的基因表現出來, 而且還能加上marker, 以便由marker之有無來檢測構建之成功與否. 在使用ligase時, 常會有各種機率的結合, 而產生非所要的結果,亦有多段結合者, 但因皆與或然率有關, 理論上仍會出現若干所要的結果.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二十五、建構重組DNA

    本實驗僅以均經限制酶切割形成有交叉缺口之雙股DNA行之. 將嫁接媒介與所要構建進入媒介的DNA適量混合, 加入1μT4 DNA ligase, 再加入適量ligase buffer及適量BSA, 置25℃, 2hr, 此種建構方式會產生因隨機結合的各種不同重組DNA, 亦有多於一段以上所要的DNA同時構建入同一媒介者. 再以電泳分離之. 再將構建好的媒介轉植入宿主細胞, 並使之增殖, 再將含重組DNA的細胞保存於甘油液中, 保存在-70℃.


    若欲檢測所要的DNA是否已進入某一宿主細胞中, 可將此宿主細菌以塗平盤法長在平盤上再以nylon濾紙蓋上, 將菌群模印在nylon濾紙上, 再將此濾紙以鉛筆做上正面(有菌群)之記號, 並以尖針在濾紙上刺四處小孔, 並與培養皿上的相對位置標好, 如:

    再將此nylon濾紙放在一張吸滿0.5M NaOH的濾紙(普通濾紙)上, 5min, 再將nylon濾紙在移放在另一張吸滿1M Tris. Cl, pH7.5的普通濾紙上, 5min, 再將nylon濾紙移放在另一張吸滿0.5M Tris. Cl, pH7.5/1.2M NaCl的普通濾紙上, 5min, 接下來將此nylon濾紙置已自動設定之UV Crosslinker中, 使DNA固定, 再進行南方式雜交, 以DNA探針找出所要DNA的菌群位置, 則可在原始培養皿上找出所要的菌群. 此nylon 濾紙可先以鋁箔紙包好高溫高壓消毒以達無菌狀態. 在印取菌群時, 勿讓nylon濾紙與平盤間有空隙.

 

 

 

 

 

二十六、南方式雜交(Southern Boltting and Hybridization)

    DNA片斷經電泳後, 再將雙股分離為單股, 然後將此單股DNA轉移至nylon膜上, 經過前處理程序, 以避免雜質影響結果, 再將具有螢光標誌的DNA探針與此單股DNA雜交, 之後將未結合的多餘單股DNA洗去, 再將nylon膜放入X光片卡夾中, 待曝光完全後, 將X光片沖出, 以檢視結果.

   

欲檢測之DNA(10μg左右)

電泳設備

DNA marker

直尺

0.2N HCl

nylon膜

Denaturation solution

    [配方]1公升dH2O中含87.75g NaCl, 20.0g NaOH保存於室溫

Naturation Solution

    [配方]1.5M NaCl, 0.5M Tris.Cl pH7.2, 0.001M EDTA

20X SSC

    [配方]每公升含175g NaCl, 88g Na3.Citrate.2H2O以1M HCl將pH調整至7.0

透明塑膠膜

Vaccum blotter

大張濾紙

0.4M NaOH液

SDS/Prohybridization solution

    [配方]每500ml中含:

12.5ml之1M KPO4, pH7.4

125m之20X SSC

25ml之100X Denhardt`s solution

-配方-每500ml中含:

10g Ficoll 400

10g Polyvinylpyrrolidone

10g BSA保存在-20℃

或以30g脫脂牛奶粉溶於500ml dH2O中取代

5ml之5mg/ml salmon sperm DNA

250ml之100﹪formamide

82.5ml之dH2O

再加入1﹪(w/v)之SDS保存在-20℃

SDS/hybridization solution

    [配方]與SDS/Prehybridization solution相似, 除不加水外, 加入50g的dxtran sulfate<分子量500,000>, 然後攪拌整夜, 第二天在水使整個體積成為500ml, 保存在-20℃.

紫外線DNA定合儀

封袋機

塑膠袋

以螢光標定之探針DNA(此一部份之製作另外說明)

X光片

X光片卡夾

暗房設備(裝X光片及沖片用)

   

1.     先將欲檢測之DNA及DNA marker依一般電泳技術執行電泳.

2.     將電泳膠取出照相(在拍照時一把直尺放在泳膠旁, 以確定各DNA片段之位置以便比較分子量).

3.     將電泳膠放入依含500ml 0.2N HCl的盤中, 緩緩搖動此盤10min.

4.     倒去HCl液, 加入dH2O清洗泳膠三次. 此時loading dye中的bromphenol blue由藍變黃, 倒去dH2O.

5.     倒入500ml denaturation solution, 緩緩搖動盤子, 15min後, 倒去液體再重複一次, 此時bromphenol blue顏色又恢復為藍色, 顯示DNA雙股以分離為單股, 倒去液體.

6.     加入500ml denaturation solution, 搖動盤子30分鐘.

7.     以利剪剪下一塊比泳膠各邊均小3mm之nylon膜, 至一盤中含20X SSC液, 液量已能遮蓋此膜為度, 5min(處理nylon膜時必須戴手套操作, 以免影響實驗結果, 因此膜極為敏感).

8.     另剪一張濾紙與nylon膜同大小, 亦浸入20X SSC液中.

9.     Vaccum blotter裝置將nylon膜放在濾紙上, 再放在多孔盤上, 再放在blotter主體凹凸狀平盤上, 在nylon膜上則放上軟塑膠墊片, 此墊片之上放泳膠, 有孔的面向上, 泳膠底繳邊均比此墊片之切割面要大至少5mm, 再蓋上blotter的蓋框.(若泳膠與nylon膜之間有任何氣泡存在, 可以玻璃吸管平平推過泳膠面, 使氣泡推出, 至完全無氣泡為止).

10.打開抽器開關, 調整吸力至5 inches水銀柱高.

11.blotter蓋框中倒入1,500ml之0.4M NaOH液, 檢查泳膠與墊片之接合是否緊密;並檢查真空吸力是否維持5 inches Hg, 做必要之調整.

12.DNA游泳膠中轉移至nylon膜上, 90分鐘, 關掉開關.

13.將裝置鬆開, 取出泳膠, 在紫外線下檢查是否有無DNA存留.(必要時可再以1.0μg/ml濃度的ethidium bromide染色一次在檢查).

14.nylon膜取出,放在2X SSC中2分鐘再取出, 此時以鉛筆在nylon膜上做記號以辨認有DNA的面.

15.nylon膜以透明膠膜包好, 有DNA的面向上, 至於紫外線DNA定合儀中照射120,000micro joules, 5min紫外線, 此時DNA已定合在膜上, 取出nylon膜.

16.nylon膜放入封閉的塑膠袋中, 並在袋中加入10ml SDS/Prehybridization液, 至65℃, 1hr後, 剪開袋角一小口, 倒出液體.

17.將準備好的帶螢光之DNA探針放小型離心管中, 在沸水中置5分鐘, 再將之加入10ml之SDS/hybridization液中, 充分混合, 再注入袋中, 再將袋角封口, 置65℃, 過夜.

18.第二天, 將袋剪開, 取出nylon膜,

先以  2X SSC/0.1﹪SDS洗 5min, 室溫;

再以  2X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫;

再以0.5X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫;

再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫;

再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗30min, 65℃.

19.nylon膜由包膜中取出, 在暗房中將nylon膜與X光片放入X光片夾中, 2天, 有DNA的面與X光片相向.

20.在暗房中, 取出X光片, 沖出, 檢視結果.

    在正常情況下, 在10μg的哺乳類DNA中, 可偵測出10pq(1pq=0.1×10-12g)的DNA, 亦即一個基因的量即可測出, 因此本實驗可比為由大海可撈針.

    此實驗中, 若所欲找的基因與探針之間的差異較大, 則雜交溫度可降低些. 在雜交液中所使用的dextran sulfate目的在促使探針DNA結合於雜交處, 但對單股DNA無用, 故不必用於前處理液中.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

運用Du Pont Renaissance Nucleic Acid Chemiluminescence Reagent 及Random Primer Biotin Labeling Kit(with streptavidin-AP) (產品編號:NEL-202, NEL-604)來進行南方式雜交

產品說明:

    NEL-202,中含4瓶試劑, 每瓶均為170ml, 其中2瓶為Enhanced Luminol Reagent, 2瓶為Oxidizing Reagent.

    此產品是為避免使用放射性物質, 但又能達到相同功能的設計, 因其能發出光線, 用於偵測附在膜上的horseradish peroxidase, 此產品與Random Primer Biotin Labeling Kit併用, 在2小時曝光情形下, 可以南方式雜交法測出約250ng的DNA含量. (亦即2.5×10-8gDNA的含量)此產品設計的原理是, 利用horseradish peroxidase(HRP)會催化luminol的氧化, 而產生光. 當膜上有HRP時, 將此Oxidizing Reagent加上去, 就會有黃光產生, 再加上enhanced luminol reagent可使此光加強1,000倍.此光的波長為428nm, 此光可用Du Pont Reflection Auto radiography底片偵測.

    HRP可附在ntrocellulose膜上使用.

    在使用時必須防止污染溶劑. 包括pipettes或pipet tips均要每次更換新品.

    再裝底片時切勿曝光, 必須在暗房操作.

使用Chemiluminescence Reagent Preparation方法

1.     在使用前取等量之Bottle 1與Bottle 2液混合, 切勿混合超過要使用之量, 用過即棄.

2.     將混合好的液體(其量為每cm2膜, 用0.125ml), 與膜放在一盤中(或可封膠袋中), 使液體與膜充分接觸, 至少1分鐘, 室溫.

偵測DNA

1.     底片必須保持乾燥, 故膜必須去除水分, 可以晾乾或輕輕在濾紙上吸乾方式乾燥膜.

2.     在暗房中, 將底片取出, 將含DNA之膜, 以有DNA的面向底片放好. 第一張底片為試片, 可以試5分鐘即沖出. 看結果, 再換新底片, 曝光2小時.

使用Random Primer Biotin Labelling Kit方法

此套Kit有下列物品:

Random Primers and Reaction Buffer 6X 濃度, 140μl

Biotin nucleotide Mix (包括Biotim-N6-dATP)

unlabeled dATP, dGTP, dTTP均為6X濃度, 140μl

unlabeled Control DNA, λ Hind III digest, 100ng/μl, 25μl

Biotin labeled control DNA, labeled λ Hind III digest, 50pg/μl, 50μl

Water, 無菌消毒過, 2ml

Kelnow Fragment, 1.5~2.5units/μl, 100μl

Streptavidim-AP conjugate, 1,000X濃度, 250μl, Blocking Reagent, 粉狀, 20g

另外, 要做南方式雜交, 必須有nitrocellulose膜.

在第一次使用後, Blocking reagant可保存在室溫, 而streptavidim-AP液, 可保存在4℃.

說明:

Kit, 是以random hexamers來產生DNA標定, 標定時以Biotin-N6-dATP為之. 以此Kit合成的DNA片段, 大約為300~600bases.

在做雜交時, Biotin-labeled DNA 先 denature, 在與目標DNA雜交,使用的為雜交緩衝液, 其中含有Blocking Reagent(可為無脂奶粉, BSA及Casein). 此緩衝液在Kit中一併提供.

在雜交後及沖洗後, 此膜再以另一中含Blocking reagint的緩衝液沖洗, 以免無關的蛋白質吸附其上, 然後, 使用streptavidim-AP, 此為高度敏感的偵測接合劑, 用於和Biotin-labeled DNA結合.

一種常效的螢光訊號, 會在加入Chemilum nesceme reagent後迅速顯現, 此訊號可持續24小時.

Biotin-labeled probe hybridization mix可保存在-20℃重複使用. 每次使用前要先denature.

使用方法

    下列的方法只夠標定25ng置1μg的模子DNA, 此DNA必須純無蛋白質, 有機溶劑等雜質. 最低濃度可至1.3ng/μl仍可標定.

    此時需另備0.1M EDTA, pH8.0以終止反應.

1.     取出Random Primers and Reaction Buffer mix, Biotin nucleotide Mix, Water, Template DNA, 0.1M EDTA液, 置室溫溶解.

2.     將上述液以離心方式10,000rpm, 5sec, 使液體聚在管底.

3.     模子DNA在標定前必須先denature, 將此DNA吸入微量離心管, 並加水, 使體積為19μl, 離心聚集液體, 將離心管置95℃, 並立即放入冰中5min.

4.     在此離心管中加入下列:

Random Primers and Reaction Buffer Mix     5μl

Biotin Nucleotide Mix                      5μl

Klenow Fragment                            1μl

使全體積為30μl

5.     離心聚集液體, 在將此離心管置37℃, 1hr, 可更長, 或overnight.

6.     加入5μl之0.1M EDTA(pH8), 此時可保存在-20℃.

預期結果

    在1hr後, 依原模子DNA濃度與合成DNA(以標定)之濃度大約如下表:

模子DNA濃度:

25ng

100ng

250ng

580ng

1μg

合成標定DNA濃度:

27ng

70ng

270ng

408ng

710ng

    若要檢測標定的效果如何, 可將標定之DNA, 與Kit中Biotin標定的對照組DNA加以比較, 方法如下:

    先取標定之DNA 2μl, 將其依上述預期結果表, 計算, 並以TE buffer稀釋至6.25pg/μl, 也將Kit中的Biotin標定之DNA對照組也稀釋成6.25pg/μl(即稀釋8倍, 因原濃度為50pg/μl). 再將上述二組DNA, 均再依下表稀釋:

 

微量離心管編號

  

     

1

6.25pg/μl

原濃度

2

1.60pg/μl

1中取4μl加入12μl T.E.

3

0.4pg/μl

2中取4μl加入12μl T.E.

4

0.10pg/μl

3中取加入12μl T.E.

5

0.025pg/μl

4中取加入12μl T.E.

    再將每組中5支微量離心管的DNA分別各吸取1μl, 分別點在nitrocellulose膜上, 再以uv crosslink將DNA固定在膜上, 再以底片曝光10min, 將兩組結果對照, 可知標定的效果. 亦可作為未來做雜交的用量參考. 依此產品之設計, 只要有0.1pg的DNA標定, 就能測出.

 

南方式雜交的應用

    此一部份, 曾在手冊中提及, 此處僅重點說明:

   

Prehybridization and hybridization buffer:

2X SSC

0.5﹪(w/v) Blocking Reagent

5﹪(w/v) Dextran Sulphate

0.1﹪(w/v) SDS

標定的探針(labeled probe)

Carrier DNA可用sheared, sonicated Salmon Sperm DNA

Stringency wash buffers

a.      2.0X SSC, 1.0﹪SDS

b.      0.2X SSC, 0.1﹪SDS

雜交程序

1.     niteocellulose膜上以有denatured目標DNA在2X SSC中混合, 使整張膜均浸透.

2.     將此膜裝入膠袋中, 加入Prehybridization buffer, 並加入最終量50μg/ml的Carrier DNA, 此時buffer量最少為每cm2膜有0.1ml.

3.     將膠袋封口, 放入65℃水浴中振盪, 至少1hr.

4.     在微量吸管中, 將探針DNA與300μl Hybridization buffer混合,並加入carrier DNA(50μg/ml),加熱至95℃, 5min, 並立即放在冰上5min, 探針量為20μg/ml, 以膜之大小而定. (每cm2, 0.1ml)

5.     在此探針混合液中, 加入0.1ml/cm2的hybridization buffer,置65℃.

6.     將袋中Prehybridization buffer倒去, 並加入(5)之液體.

7.     將膠袋封起, 此時, 視膜子DNA與探針DNA結合的長度, 若在500bp以上時, 則置65℃, 若在500bp以下時, 則置60℃, 於振盪水溶箱中, 過夜.

8.     第二日, 將膜取出, 將洗膜用的2X SSC(含1.0﹪SDS) buffer先預熱至雜交濃度, 在以每cm2至少1ml的量來洗膜15min.

9.     在以0.2X SSC(含0.1﹪SDS), 洗膜15min.

偵測雜交結果:

   

buffer 1

1X PBS, pH7.4        以0.22μm濾膜過濾

0.05﹪Tween 20

0.1﹪SDS

buffer 2

1X PBS

0.05﹪Tween 20

0.1﹪SDS

0.22μm濾膜過濾後加入Blocking Reagent

0.5﹪w/v Blocking Reagent

conjugate solution(配合buffer 2)

1X PBS, pH7.4

0.05﹪Tween 20

0.1﹪SDS

0.5﹪(w/v) Blocking Reagent

1/1,000(w/v) Streptavidim-AP conjugate

buffer 3

0.1M Tris-cl., pH9.5

0.1M NaCl

   

1.     將膜放入Buffer 1中洗5min, 用量為每cm2膜至少10ml.

2.     將膜放入Buffer 2中1hr, 緩緩振盪, 用量為每cm2膜至少1ml.

3.     將膜放入conjugate solution中1hr, 緩緩振盪, 用量為每cm2膜至少0.1ml.

4.     在將膜放入Buffer 1中洗5min, 洗4次.

5.     在將膜放入Buffer 3中洗5min, 洗2次.

 

    接下來為使膜上雜交結果放光的程序, 使用材料為NEL 601套材中的材料.

   

1.     將先前洗好的膜, 轉至一清潔皿中.

2.     以每cm2, 0.05ml的CDP-StanTm液完全覆蓋膜5min.

3.     將膜以透明膠布(包剩藥用的即可)包好, 以防水弄濕底片.

4.     將含DNA面的膜與底片放好, 夾入感光夾中, 先測試一張5min, 沖出看結果, 再以另一底片曝光1hr.

以下為緩衝液及有關溶液的配方:

1.     0.1M EDTA, pH8.0:

*以10ml量準備, 可用1.86g Na2-EDTA-2H2O加入8ml dH2O中, 以5N的NaOH調整pH至8.0, 在以dH2O將全量調整至10ml.

2.     TE buffer(10mM Tris-Cl, pH7.5, 1mM EDTA):

*以ll量準備, 可將1.22g之Tris-Cl與0.4g之Na2-EDTA-2H2O與500ml之dH2O混合, 以HCl調整pH至7.5, 再加dH2O使全量為ll, 再以0.22μm濾膜過濾.

3.     20X SSC:以ll量準備:

*以175.4g的NaCl及88.2g的Sodium citrate, 加dH2O至ll, 再以0.22μm濾膜過濾.

4.     DNA Prehydridization and Hybridization buffer:

2X SSC

0.5﹪(w/v) Blocking Reagent

5﹪(w/v) Dextran Sulphate

0.1﹪(w/v) SDS

100ml量準備:

    以100ml之20X SSC, 加0.5g Blocking reagent, 再加50ml dH2O, 加熱攪拌至60℃, 以便Blocking reagent能溶解, 再加入5g的dextran sulphate(分子量500,000), 攪拌至溶解. 再加入0.1g的SDS, 並加入dH2O使體積為100ml, 保存在-20℃.

 

預期結果

在底片上應有黑點出現,

若無, 可能為模子DNA有污染,

若底片太黑, 可能為背景太強, 最可能為膜受污染, 應防止以手指觸摸, 應戴手套.

若黑點太深, 可少加些探針DNA, 並減少曝光時間.

無黑點亦有可能是denaturation不完全, 或模子DNA未固著, 或探針未能完全denaturation, 此膜可再度使用.

若黑點模糊, 可能為底片移動.

 

 

 

二十七、使用BrightStarTM Psoralen-BiotinNonisotopic Labeling Kit 標定核酸(DNA, RNA均可用)

    本套組設計原理為, 將Psorlen-Biotin液與核酸共置microtiter plate中, 以365nm的紫外線照射15~60min, Psorlens會與核酸中的T, U, C結合, 多餘的Psorlen-Biotin 液可用butanol萃出.

注意:

1.     Psorlen-Biotin液見光分解, 故必須以鋁鉑紙包起, 並置暗處, 保存於-20或-70℃.

2.     本套組需與Ambions BioDetect Kit配合使用.

   

(供標定0.5μg/10μl核酸之用, 不同量可依比率比照, 最高量5μg/100μl) (所有程式應在暗光下進行)

1.     取一microtiter plate將DNA置入格中, microtiter plate置100℃水浴或heating plate上, 10min, 使DNA denature, (若為RNA則省此步驟), 再立即置microtiter plate於冰上.

2.     將含Psorlen-Biotin粉的試管離心7,000xg, 15sec, 再加入33μl之dimethylformamide, 使溶解, 以鋁鉑紙包起, 並置暗處, 保存於-20或-70℃.

3.     1μl之Psorlen-Biotin液, 加入含10μl核酸的Eppendorf離心管中, 混合後, 吸入microtiter plate格中.

4.     365nm UV light在microtiter plate上照45min. (距離2cm.)

5.     加入89μl之1X TE, 混合, 吸入Eppendorf離心管中.

6.     加入200μl dH2O-saturated n-Butanol, vortex, 離心7,000rpm, 1min, 吸除上清, 如此, 重復2次, 將成品保存-70℃.

 

使用BrightStar Biodetect (Nonisotopic Detection Kit)的方法

    下列步驟係供100cm2的membrane使用, 不同size可依照比率調整. 在整個過程中membrane 必須保持濕潤.

1.     先依需要量將5x wash buffer與10x assay buffer以dH2O調成1x.

2.     1x wash buffer緩搖洗membrane 5min, 2次(1ml/cm).

3.     Blocking buffer緩搖洗membrane 5min, 2次(0.5ml/cm).

4.     Blocking buffer緩搖洗membrane 30min, 1次(1ml/cm).

5.     Conjugate Solution(10ml Blocking buffer+1μl Streptavidine alkaline Phosphatase Conjugate/100cm2)緩搖洗membrane 30min, 1次.

6.     Blocking buffer緩搖洗membrane 10min, 1次(0.5ml/cm).

7.     1x wash buffer緩搖洗membrane 5min, 3次(1ml/cm).

8.     1x Assay buffer緩搖洗membrane 2min, 2次(0.5ml/cm).

9.     CDP-StarTM緩搖洗membrane 5min, 1次(5ml/100cm2).

10.取出membrane 抖去多餘水份, 以保鮮膜包起, 要平, 不要有鄒折, 且只有1層, 置入X光片夾中, 室溫2~4hr (不必太久). 再去沖片.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二十八、Polymerase Chain Reaction(PCR)

DNA連鎖合成反應

    PCR是應用一種由高溫生存細菌的DNA合成, Taq DNA Polymerase, 加上Primers及dNTPs, 再能控制溫度循環的合成儀中, 先加熱使原本之DNA由雙股分成單股, 再降溫至Primers可與單股DNA結合, 再升溫至DNA合成酶能充分運作, 一段時間後, 又升溫使DNA分為單股, 再降溫使Primers結合,再升一點溫使DNA合成酶能充分運作, 如此不斷循環, 約20~30次之後, DNA就可將特定片段倍複製達數百萬次, 如此用以偵測微量DNA或測DNA中有無特殊排序等, 應用十分廣泛.

   

10X及1X PCR reaction buffer

8mM dNTP mix

Oligonucleotide PCR Primers (上行與下行二股)

DNA模子

5μ/μl Termus aquaticus DNA Polymerase (Taq Polymerase)

Mineral oil

a thermal cycler

      

1.     在微量離心管中加入:

10μl 10X PCR reaction buffer

10μl 8mM dNTP mix solution

10μl 10μM 上行(Upstream) PCR Primer

10μl 10μM 下行(Downstream) PCR Primer

59μL template DNA(1μg in nuclease free dH2O)

1μl Taq Polymerase(2.5μ/μl)

若體積因各項成分的濃度之故未達100μl 可以1X PCR buffer調整.

2.     加入100μl mineral oil(防止蒸發)

3.     設定thermal cycler, 使先加熱至94℃, 使DNA分成單股, 2min.

4.     在設定DNA復合溫度, 此溫度隨Primer之組成而不同. 大致可以下列經驗公式推估:

     Tm=81.5+16.6(logM)+0.41(GC﹪)-(500/n)

其中n=Primer的長度

M是緩衝液中的鹽分濃度摩爾數(不計Mg++的濃度)

例如, NaCl濃度為0.04, Tris濃度為0.67, 則為:

   0.04(NaCl)+0.67×0.01(Tris)=0.047M salt

若以25個bp的Primer而言, 其Tm為

   Tm=81.5+16.6(log0.047)+0.41(60)-(500/25)=64

而通常復合溫度為Tm+22度=66度. 但若一時未便估算, 則以55℃進行, 一般也可成功.

進行一分鐘.

5.     再設定DNA合成溫度75℃, 2min. 在2分鐘時間, DNA至少可合成1,000bp.

6.     如此設定thermal cycler循環3~5過程3次.

7.     取出10μl(取在mineral oil下層液體部分), 以電泳檢試結果.

    以下將各有關材料參考資料列出供不時之需(一般均係向廠商直接採購時索取或調好者, 此處為若需自行調配時參考用)

8mM dNTP:將2mM之每種(共4種)dNTP混入, 保存在-20℃.

Oligonucleotide PCR Primers:以dH2O調成10Um, 保存在-20℃.

10X PCR buffer:50mM KCl          100mM Tris.Cl, pH8.4

                  15mM MgCl2        200μg/ml gelatin

Taq DNA polymerase:通常以5μ/μl濃度出售, 而使用時每100μl, 只要1.5~2.5μ即足, 故在使用前可以PCR buffer調整濃度. 此酶無proof reading功能, 亦未明顯發現有exonuclease的功能. 最適宜的反應溫度為75~80℃.

*在PCR反應中, 下列條件必須注意:

1.         至少要有2μTaq polymerase/100μl reaction

2.         1.5mM之Mg+2/0.8mM dNTP mix

3.         100 Pmol each Oligonucleotide PCR Primers

二十九、分離細胞核技術

    將真核細胞的細胞核與細胞其他部分分開, 以利其他實驗之用.

   

Lysis buffer

[配方] 10mM Tris.Cl, pH7.4    3mM CaCl2

        2mM MgCl2

Nonidet P-40(NP-40) lysis buffer B

[配方] 10mM Tris.Cl, pH7.4    3mM CaCl2

        2mM MgCl2              1﹪NP-40

       (前三項配合先高溫高壓消毒後, 待冷卻再加入NP-40)

均質器

   

1.     對單層組織培養細胞, 可先到去培養液, 以5ml, 4℃ PBS清洗細胞二次, 再以高溫高壓消毒過之軟膠刮刀將細胞刮下, 並離心1,500rpm, 5min, 4℃; 若為浮懸細胞, 則直接離心1,500rpm, 5min, 4℃, 並以4℃ PBS洗細胞二次(離心, 倒去上清), 本實驗均以5×107細胞量設計.

2.     將細胞溶於15μl, 4℃, lysis buffer中, 緩緩混合, 10min.

3.     離心4℃, 1,500rpm, 5min, 倒去上清, 再將細胞溶於1ml lysis buffer中.

4.     再加入1ml NP-40 lysis buffer B, 緩緩充分混合.

5.     將細胞吸入均質器, 攪動10次, 取少數液置血液計數器, 在顯微鏡下檢視細胞是否只剩細胞核.

6.     將只剩細胞核的細胞溶轉入無菌離心管中, 離心1,500rpm, 4℃, 5min.

7.     仔細吸除上清, 將沉澱之細胞核置冰上, 再加入200μl之甘油保存液(配方:50mM Tris.Cl, pH8.3

40﹪ glycerol

5mM MgCl2

0.1mM EDTA),

使細胞核溶於液中, 在將之保存在-70℃中.

.三十.蛋白質的抽提, 純化與計量

測蛋白質之量:

Bradford法:

利用染劑Coomassie Brilliant Blue會與蛋白質結合的性質, 再與已知蛋白質濃度之標準曲線比較, 而估計蛋白質之量.

   

0.5mg/ml bovine serum albumin(BSA)

0.15M NaCl

Coomassie Brilliant Blue 液

實驗步驟

1.     4支微量管中, 分別放入0.5mg/ml BSA液5, 10, 15, 20μl再以0.15M NaCl液加入使達總體積100μl再以1支微量管加入100μl之0.15M NaCl, 此為控制組.

2.     在每試管中加入1ml之Coomassie Brilliant Blue液, 並充分混合, 置室溫2分鐘.

3.     以光譜儀測A595, 訂出標準曲線, 再測未知濃度液, 已查出其濃度. 但若未知液濃度太大, 可稀釋後再測.

附註:

1.     Coomassie Brilliant Blue液製法:以一個1公升的錐形瓶, 溶解100mg之Coomassie Brilliant Blue G-250於50ml之95﹪酒精中, 再加100ml的85﹪phosphoric acid液, 再加入dH2O使達1,000ml, 再以濾紙過濾, 並保存在4℃中備用.

2.     甘油, 洗潔精, 2-mercaptoethanol, acetic acid, ammonium sulfate, Tris等均會影響測定結果.

 

 

 

 

.三十一.以電泳分離蛋白質

一度電泳可依蛋白質的分子大小分離蛋白質, 並能測出各蛋白質的構成分子大小及多少單位. 電泳膠中的蛋白質亦可抽出.

蛋白質的純與否及分子大小, 可再電泳膠中加入0.1﹪SDS來分析. 但若加入SDS, 則蛋白質的功能將喪失.

在電泳時, 注意用電之安全. 在開電源前將伏特數關至0, 開電源後才調整之. 關電源前先關伏特數至0才關電源.

執行一度電泳, 且以denatured方式行之時, 應先將蛋白質與SDS一起煮沸, 再加入2-mercaptoethanol(2-ME)或dithiothreitol(DTT)以解開蛋白質的雙硫鍵, 以分解蛋白質的各單位.

在使用泳膠時, acrylamide的濃度在5﹪時, 可用於60~200Kda的SDS-denatured蛋白質, 10﹪的用於10~70Kda, 15﹪的用於12~45Kda.

蛋白質可與等量之2X SDS液在100℃煮5分鐘, 備用. 若結果要以Coomasassie blue染色, 所需的每孔約25至50μg蛋白質. 如以銀染色, 可只要上述量的1/10. 每孔所加的量應相同, 加入1X SDS電泳液, 使電極能浸入液中. 以0.75mm後的泳膠而言, mini-gel, 用15mA, 約需2小時. 若為1.5mm後的泳膠, 則應用30mA, 防止過熱, 應以水流冷卻之. 在Bromphenol blue染劑跑至底端時, 即可停止.

若係非denatured gel, 即不含0.1﹪SDS, 蛋白質的分離依其分子大小, 形狀及電極而分.

所用之液體均不含SDS及2-ME or DTT, 也不必煮沸標本, 但在標本溶在2X Sample buffer之後, 要離心10,000xg 15min, 除去不溶的沉澱. 再取上清液至另一微量離心管中, 備用.

若將polyacrylamide gel使用梯度(gradient)方式, 能將蛋白質分的更清楚, 且能分出10~200Kda的蛋白質.

為節省時間, 採用市售已做好的gel, 可避免冗長的麻煩, 又避免接觸acrylamide粉(未形成polymer前對人有害), 及TEMED等物質. 又不必採購gradient maker等儀器.

 

所需之各項buffer配方:

1.     5x SDS/electrophorsis buffer:

15.1g Tris base

72.0g glycine

5.0g SDS

˙再加dH2O至1,000ml, 不必調整pH.

˙若採不用denaturation, 則不加SDS.

˙在使用時, 加入dH2O, 使成1X, pH即為8.3.

2.     2X SDS/sample buffer:

25ml 4x Tris Cl/SDS, pH6.8 (見後配方)

20ml glycerol

4g SDS

2ml 2-ME或3.1g DTT

1mg Bromophenol blue

˙加dH2O使成100ml, 以1ml量保存在微量離心管終於-70℃.

˙若不要denatured蛋白質, 則不加2-ME或DTT, 及刪去SDS.

3.     6x SDS/sample buffer配方:

7ml 4x Tris Cl/SDS, pH6.8 (見後配方)

36ml glycerol

1g SDS

0.93 DTT

1.2mg Bromphenol Blue

˙加dH2O至10ml.

˙以0.5ml存微量離心管中, 存-70℃.

˙若不要denatured proteins, 則刪去SDS, DTT.

4.     4x Tris Cl/SDS, pH6.8配方:

˙將6.05g Tris base加40ml dH2O, 以1NHCl調整pH至6.8, 再加dH2O至100ml, 再以0.45μm濾膜過濾, 再加入0.4g SDS, 保存在4℃.

˙若不要denatured Proteins, 則不加SDS.

5.     4x Tris Cl/SDS, pH8.8配方:

˙將91g Tris base加300ml dH2O, 以1NHCl調整pH至8.8, 再加dH2O至500ml, 再以0.45μm濾膜過濾, 再加入2.0g SDS, 保存在4℃.

˙若不使用denatured Proteins, 則不加SDS.

 

若將denatured Proteins與未denatured Proteins結果比較, 可得知一個蛋白質的構成單位之分子大小. 但無法正確計算分子之絕對大小. 因電泳後蛋白質形狀, 大小及電極均有影響.

如果電泳的結果有條帶二測上彎現象, 表示過熱, 應以控制溫度為之, 若染劑擴散, 則緩衝液應更新, 若蛋白質條帶擴散, 則應增強電壓  (25﹪), 若產生垂直條帶, 則表示蛋白質中有沉澱, 應以離心處理標本, 再電泳.

Bromphenol blue solution:(working solution)

   50﹪glycerol(v/v)+10ml/liter concentrated Bromphenol blue

 

三十二.由電泳膠中取出蛋白質

   

1.     將泳膠取出, 至於Coomassie Brilliant Blue染劑液中浸15分鐘. 室溫.

2.     將染色之泳膠至destaining solution中2hr, 4℃. (此時可將Kimwipes放在浸洗皿的四角, 可吸取染劑)

3.     以小刀片將含蛋白質的band切下.

4.     將小塊泳膠置4℃, 水中, 2hr, 並每隔30min, 換水一次.

5.     將清洗的泳膠置10cm培養皿中, 加10ml水, 將泳膠切成1mm3左右大小, 並堆在一起, 並以吸管將水吸除.

6.     Tris/acetate緩衝液, 及適當透吸膜, 電析, 將蛋白質由膠中取出. (所需的模孔, 必須比所需的蛋白質分子小)

7.     Electro-Eluter電析設備裝置設定, 並將泳膠在elution buffer中浸3小時. 在設定固定50v, 電析12hr.

8.     elution buffer倒去, 換入透析buffer, 設定80v, 透析20hr.

9.     以針頭吸取含蛋白質的液體, 存微量吸管中, 保存於-20℃, 或以4倍量之methanol/acetone 50:50v/v將蛋白質沉澱在離心倒去上清保存於-20℃.

附註:

使用Coomassie Brilliant Blue染色蛋白質時, 蛋白質的量至少要2~3μg 才能顯出, 而已銀染色, 只要2~5μg就可看出.

 

各種溶液及緩衝液配方:

Destaming solution:

50ml acetic acid

165ml methanol

785ml dH2O

Dialysis buffer (0.1M NH4HCO3):

4.0g NH4HCO3溶於500ml H2O中, 並加入0.1﹪w/v的SDS.

Elution buffer (0.05M NH4HCO3):

1.98g NH4HCO3溶於500ml dH2O中, 並加入0.1﹪w/v的SDS.

Soaking Solution (0.4M NH4HCO3):

3.19g NH4HCO3溶於100ml dH2O中, 並加入2﹪w/v的SDS.

Staining Solution:

1ml acetic acid

3ml isopropanol

6ml dH2O

0.5﹪(w/v) Coomassie Brilliant Blue solution.

 

 

透析膜之處理:

有分子量1,000, 2,000, 3,500, 8,000, 10,000, 25,000, 50,000等不同, 依蛋白質之分子量選孔不大於所需蛋白質的膜, 將膜剪下一段所需長度, 浸在 1﹪ammonium bicarbonate, 60℃, 1hr, 再以dH2O洗淨, 再浸於0.1﹪SDS,     60℃, 1hr, 再以dH2O洗淨.

亦可用不含SDS的Tris/acetate buffer來做elution或dialysis, 4℃.

另外在gel中蛋白質的染色, 也可用4M sodium acetate, 1hr, 室溫, 即可顯出透明的蛋白質帶及不透明的gel背景.

若使用Coomassie blue必須經destain過程. 並再以7﹪(v/v)的acetic acid穩定之, 再以相機照相存證.

 

 

 

 

 

電泳膠中蛋白質染色法:

1.     將泳膠取出裝入依塑膠盒內, 並加入膠體積5倍量的fixing solution, 輕輕振盪2hr.

2.     fixing solution倒去, 加入Coomassie staining solution 4hr, 並輕輕振盪.

3.     倒去Coomassie staining solution, 以50ml fixing solution清洗gel.

4.     倒去fixing solution, 再加入新的destaining solution, 輕輕振盪2hr.

5.     倒去destaining solution, 再加入新的destaining solution, 直至蛋白質帶清處顯出, 再將gel放在7﹪acetic acid中.

6.     照相保存紀錄.

7.     乾燥gel(用一般的gel dryer), 將gel上下各設3MM Whatman filter paper並以透明膜包好, 再以80℃乾燥1hr.

 

另外亦可用快速染色法, 再30min內看出結果, 其所用之材料如下:

isopropanol fixing solution

Rapid Coomassie staining solution

10﹪acetic acid

   

1.     將泳膠取出, 至塑膠盒中, 以isopropanol fixing solution泡, 置室溫, 視泳膠厚度泡不同時間, 0.7mm泳膠, 15min;1.5mm泳膠, 30min.

2.     倒去fixing solution, 加入rapid Coomassie blue staining solution, 置室溫20min.

3.     倒去staining solution, 加入10﹪acetic acid, 以緩緩振盪1hr, 至背景清楚. 必要時更換新10﹪acetic acid液在洗, 完成後, 將膠保存在7﹪acetic acid液中, 或以在透明膠布中存4℃.

4.     必要時將泳膠照相.

泳膠亦可用銀染色, 銀會與蛋白質的sulfhydryl和carboxyl moieties作用, 而呈色. 因敏感度高, 過程中應戴手套.

   

Fixing and destaining solutions

10﹪(v/v) glutaraldehyde (使用前以濃保存液稀釋於dH2O中)

Silver nitrate solution

Developing solution

Kodak Rapid Fix sloution A(#8323917)

   

1.     將泳膠取出, 至塑膠盒中, 加入膠體積5倍的fixing solution, 緩慢振盪30min.

2.     倒去fixinig solution, 加入5倍膠體積的destaining solution, 緩慢振盪1hr.

3.     destaining solution倒去, 加入膠體積5倍的10﹪glutaraldehyde, 在抽氣或通風處, 緩慢振盪30min.

4.     倒去glutaraldehyde, 以dH2O洗泳膠4次, 每次30min.

5.     將水倒去, 以5倍膠體積的AgNO3液染色, 15min, 並振盪之.

6.     將泳膠換入另一盒中以5倍膠體積的dH2O沖洗, 5次, 每次1min, 倒去水.

7.     25ml developing solution加入500ml dH2O中, 再將此稀釋過之developing solution, 取5倍膠體量, 加入盒中, 直至蛋白質染色呈現.

8.     developing solution倒去, 加入Kodak Rapid Fix Solution A, (足夠cover gel), 5min.

9.     倒去Solution A, 將gel以水沖洗5min.

10.gel照相.

另外還有一種noammoniacal Silver Staining使用比上列方法更穩定的溶液, 並可偵測出上述方法或許偵測不出的蛋白質.

   

此法所需材料與上法有許多相同, 另外加下列材料:

5μg/ml DTT

0.1﹪silver nitrate(保存在不透光瓶中, 可保存約一個月)

Carbonate developing solution

2.3M citric acid

   

1.     將泳膠放入一玻璃盤中, 或塑膠盒中, 加入100ml fixing solution, 緩慢振盪30min.

2.     倒去fixing solution, 加入developing solution, 緩慢振盪30min.

3.     倒去developing solution, 加入10﹪glutaraldehyde 20ml, 緩慢振盪10min. (應再通風處為之) (戴手套) (此一過程可使微量蛋白質也能顯出).

4.     倒去glutaraldehyde液, 以水清洗泳膠, 1hr.

5.     倒去水, 將泳膠浸於100ml的5μg/ml液之DTT中, 30min.

6.     倒去DTT, 不必清水沖洗, 直接加入100ml之silver nitrate, 緩慢振盪30min.

7.     倒去silver nitrate以清水沖洗泳膠一次, 再以carbonate developing solution沖洗2次.

8.     將泳膠浸於100ml carbonate developing solution, 並緩慢振盪, 至染色顯出為止.

9.     加入2.3M citric acid(用量為每100ml carbonate developing solution加5ml), 緩慢振盪10min. (此一過程用於平衡pH, 若未平衡, 則結果不佳)

10.倒去上述液體, 以清水沖洗泳膠3次, 第三次並緩慢浸泡並振盪10min.

11.將泳膠照相, 或將泳膠以0.03﹪的Sodium carbonate泡10min, 在取出以膠袋裝好封口保存.

各種溶液配方:

Carbonate developing solution:

0.5ml 37﹪formaldehyde per liter solution

3﹪(wt/vol)sodium carbonate

Coomassid Blue Staining Solution:

50﹪methanol(v/v)

0.05﹪(v/v)Coomassie Brilliant Blue R-250

10﹪(v/v)acetic acid

40﹪dH2O

Coomassid Brilliant Blue R溶於酒精, 再加入acetic acid及dH2O可保存6個月, 如有沉澱可以過濾去除之.

Destaining solution:

5﹪methanol

7﹪acetic acid

88﹪dH2O

室溫下可保存一個月.

Developing solution:

0.5﹪Sodium Citrate

0.5ml 37﹪formaldehyde solution

再加入dH2O使達100ml.

在室溫下可保存一個月.

Fixing Solution:

50﹪(v/v)methanol

10﹪(v/v)acetic acid

40﹪dH2O

室溫下可保存一個月.

Isopropanol fixing solution:

25﹪(v/v)isopropanol

10﹪(v/v)acetic acid

室溫下可長期保存.

Silver nitrate solution (ammoniacal):

3.5ml約30﹪的NH4OH加入42ml的0.36﹪NaOH中, 再加入dH2O, 使總體積成為200ml, 以攪拌子攪拌, 再加入8ml的19.4﹪(1.6g/8ml) silver nitrate, 如果溶液混濁可再加NH4OH至澄清為止, 並應立即使用.

此溶液在自然乾燥過程中有可能爆炸, 故未用完的液體應以等量1M HCl沉澱, 再以大量水沖洗之.

 

附註:

Coomassie Brilliant Blue會與蛋白質相結合, 但不會與Polyacrylamide gel相結合, 故經清洗後會有條帶出現.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.三十三.以柱狀層析法純化蛋白質

通常可以下列步驟思考:

選擇一種層析法                           選擇一種buffer

 

 

 


以此buffer來浸此層析用的填粒並填柱

(並準備fraction collector)

測柱內有效, 無效體積

放入樣本

收集層析結果

將蛋白質中鹽分去除

分析蛋白質的純度及劑量

 

Immanoaffinity層析法外, 其他層析法均無法一次達到蛋白質純化的目標.

一般而言, 對可溶性蛋白質, 常先將組織均質, 在過濾及以離心機去除雜質, 再以ammonium sulfate(20﹪~50﹪)將蛋白質沉澱, 再以透析法將ammonium sulfate去除, 在由此開始純化之.

如果此一蛋白質可耐熱, 則加熱以除去proteases有助於其純化.

若係附於membrane上的蛋白質, 則應以非離子性的detergent來粹取, 並且在層析中也要加入含此detergent的buffer.

 

 

 

 

 

.三十四.Gel-filtration Chromatography

此法可依蛋白質的分子大小區別之, 並可去除蛋白質的鹽分, 小片斷或  胺基酸.

   

gel-filtration(GF) matrix (選擇法參考後附表)

GF buffer

GF protein

GF Chromatography column

測水平儀 (有水泡中間的簡便式即可)

Fraction Collector

1﹪dextran blue solution (1G dextran blue in 100ml dH2O)

   

1.     先將GF的gel matrix粉泡在buffer中使平衡. 若係買已泡發的, 要在填柱後以buffer多沖洗幾次以除去抗生素.

2.     填柱, 必須小心均勻, 不可行成層狀.

3.    

 

接一條膠管, 使另一端高與柱內液面齊.

 
在柱子填好之後, 可以下法保存柱內液體免其流失

 

 


4.     以一之手電筒, 在柱後照, 此便檢查所填的柱有無空隙.

5.     1﹪dextran Blue液1ml加在柱面上方, 並開始加入buffer, 檢測Bed volume.

6.     在測得Bed volume後, 試將一已知分子量之蛋白質樣本(濃度約0.2~0.5mg/ml)加入1﹪bed volume量. 此外可參考柱內體積之計算為πr2h, r2為柱之半徑, h為柱高, 若Bed volume為未知, 可以h=0.01(即1﹪)估算此體積.

7.     開始加入buffer, 並開始收集釋出液, 以fraction collector收集之, 一般均收集100次, 每次以Bed volume的1﹪為準. 再測每一個收集液的A280, 將含蛋白質的體積計算為void volume, 一般而言, 大約均為Bed volume的1/3.

8.     在測得voice volume後, 即可將要分離的蛋白質溶於buffer中, (以bed volume的1﹪~5﹪量為佳, 濃度估計不超過70mg/ml為宜).

9.     測各次收集液的A280(此波常針對含tyrosine或trytophan的蛋白質均可測出). 並計算其蛋白質之量.

10.可將各次結果進行電泳.

11.亦可將混合蛋白質標準液之結果與標本結果比較, 以估計標本蛋白質之分子量.

附註:

    此一方法亦可用於蛋白質去鹽, 常用的gel matrix為Sephadex G-25, 去鹽後之蛋白質會在void volume中出現, 而鹽分及小雜質會在緊接Bed volume後出現.

 

選擇層析柱填料(gel matrix)的參考

如果所要分離的蛋白質分子量是未知的, 宜選擇分離分子量涵蓋範圍較廣的, 並且在試過之後, 若蛋白質在很接近bed volume時就會出現, 則要選可分離更小分子的填料再試, 若蛋白質均出現在void volume中, 則要再選可分離更大分子的填料再試.

下列為參考選擇表:

以蛋白質分子大小分離蛋白質的柱狀層析填料選擇參考表:

   

最小分子大小

最大分子大小

Sephadex G-10

700

 

Sephadex G-25

800

4,000

Sephadex G-50

1,500

3,000

Sephadex G-75

3,000

70,000

Sephadex G-100

4,000

1×105

Sephadex G-200

5,000

2.5×105

Bio-Gel A-0.5m

10,000

5×105

Bio-Gel A-1.5m

10,000

1.5×106

Sephadex 4B

60,000

20×106

Sephadex 2B

70,000

40×106

通常正式用於分離蛋白質的柱子, 至少要長50cm, 直徑1~2.5cm, 用以去鹽的則25cm, 直徑2.5cm為佳.

   

Desalting solution:

0.05M NH4OH或acetic acid均可, 因此二種均有揮發性, 在乾燥時可完全除去.

Gel-filtration buffer:

Tris, phophate及acetic buffer以不同pH來使用, 使離子濃度至少應在0.05M, 以免與gel matrix所要分離的蛋白質起作用. 如有必要可加NaCl, urea等, 使蛋白質充分溶解.

Gel-filtration protein standards:

可向廠商採購混合標準液或自己將已知分子量的蛋白質混合使用.

例如:BSA 分子量66,000

附註:

1.     Gel filtration是依分子量大小分離蛋白質, 愈小的分子, 愈會鑽入matrix(填料)的孔中, 延遲流下來的速度, 亦可採高效液相層析儀(HPLC, high-performance liquid chromatography)處理, 但使用HPLC時, void volume是Bed volume的1/2而非1/3.

2.     若不溶於水的蛋白質, 可試溶於6M guanidine.Cl及8M urea液中.

3.     在柱子填好, 不使用期間, 防止細菌孳生, 可在buffer中加入0.02﹪的Sodium azide, 但在使用前應用buffer將此含sodium azide的液體沖除.

4.     使用之樣本量不宜多過volume的5﹪.

5.     流速不宜小過2cm/hr或大過10cm/hr.

6.     填充物在90℃, 約5小時可膨脹至可用程度.

7.     柱狀層析除以分子大小層析外, 上有以離子交換層析, 免疫親和層析等方式, 有機會再行介紹.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.三十五.以HPLC純化蛋白質

此法亦有以分子大小, 離子交換, 逆相, 厭水性交互作用等不同方式.

HPLC適於微量蛋白質的分離, 且可在短時間內達成. 逆相法場會使蛋白質分子失去生物活性, 離子交換與厭水性法均無此缺點, 分子大小法所分的分子大小範圍會比普通用的柱狀層析小一半, 且可對很小量的樣本進行分離. 此處僅介紹以分子大小來分離蛋白質的方法. 此法依蛋白質分子大小, 大分子先分出, 小分子後分出.

   

degassed, HPLC-grade H2O

size-exclusion(SE) buffer

SE protein standards

0.75×30cm SE column

   

1.     將保存液(storage solvent) (此處使用methanol)由column中洗除(用degassed HPLC-grade H2O), 以flow rate 1ml/min.

(在使用完之後, 以水洗去buffer salts, flow rate 1ml/min 30min, 再以methanol洗column 30min, 1ml/min)

2.     在室溫下使SE column平衡於1ml/min, H2O中.

3.     試測一次, 以100μl SE buffer來測, 將結果列印紙上畫上一橫表示開始處, 並設定紙的速度為0.5cm/min, 而吸收度的單位則應依蛋白質濃度調整, 0.1宜於100pmol, 0.3宜於500pmol, 0.5宜於1nmol,1.0宜於2nmol, 若結果顯示有污染之峰波, 且經一在測驗均無法消除, 則buffer或column或二者均要更換了.

4.     SE蛋白標準液離心5min, 2,000xg, 抽取100μl測試, 如果峰高超過列印紙大小, 可調整之, 若結果比void volumn大於2.5倍以上, 則表示蛋白質吸附在column上.

5.     決定每個峰的elution volume, 在繪以log10為縱軸, 各峰之elution volumn(ml)為橫軸的圖, 以便做測未知標本的參考.

6.     接下來座標本. 方法比照過程3, 4.

SE buffer配方:

20mM Sodium acetate, pH5.6

150mM NaCl

SE protein standards:

2.0mg thyroglobulin

4.0mg catalase

3.0mg bovine serum albumin

3.0mg ovalbumin

4.0mg ribonuclease A

再加6ml SE buffer並緩緩混合, 必須完全溶解, 並應在顯微鏡下查看無沉澱後, 在離心一次, 取上清液使用.

附註:

1.     SE HPLC 層析法, 所得的每個蛋白質的elution volume與各蛋白質的log10(分子量)有關.

2.     SE buffer亦可用Sodium phosphate(pH5~8)並含0.1~0.4M之NaCl.

3.     所得之結果可再以電泳法來測分子量.

4.     SE-HPLC層析柱之選擇, 可參考如下:

Toya Soda SW

G 2,000 SW 用於分子量30,000以下

G 3,000 SW 用於分子量30,000至500,000

G 4,000 SW 用於分子量500,000

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.三十六.由Blot Transfer Membranes檢測蛋白質

    在電泳膠中的蛋白質, 可以轉移至nitrocellalose膜上, 凡量≧50ng的蛋白質條帶, 可以用India ink染色而呈黑色.

   

Tween 20液:

0.3﹪(v/v) Tween 20溶於PBS, pH7.4 India Ink液

0.1﹪India ink in Tween 20液

   

1.     將已Blot在nitrocellulose膜上之蛋白質, 一同放入塑膠盒中, 以Tween 20液浸泡, 並緩慢振盪, 共洗2次, 每次20分鐘.

2.     將膜以India ink染色3hr, 或過夜亦可.

3.     將膜以Tween 20液沖洗, 並destain(亦用Tween 20液), 至清楚為止. 再將膜取出晾乾.

 

上述過程尚可最預先處理, 以加強染色效果.

   

1﹪KOH

PBS

   

1.     將含有蛋白質的膜放入含1﹪KOH的玻璃盤中, 浸5分鐘.

2.     PBS浸洗2次.

附註:

    在處理膜時均應以夾子處理, 勿以手直接接觸.

 

 

 

 

 

.三十七.Western Blotting

蛋白質SDS-PAGE(Polyacrylamide gel electrophoreais) 或Thin layer chromatography, 再轉至nitrocellulose paper上, 再以antibody探針附其上, 此antibody可以horseradish peroxidase(HRPO)-Ig附著, 再將此膜浸入作用成分中使顯現結果.

   

0.1﹪SDS in PBS

Electroblotting buffer

Ponceau S Solution

Blocking buffer

Primary antibody

Horseradish peroxidase(HRPO)-anti-Ig conjugate

PBS

Diaminobenzidine(DAB) substrate solution

Whatman 3MM filter paper

Scotch-Brite pads(3M)

0.45μm nitrocellulose mambrane filter

Electroblotting apparatus or Transflot appratus

Heat-sealable plastic bag Photographic equipment

Photographic equipment

Plastic box

   

1.     首先將蛋白質標本電泳.

2.     SDS-PAGE電泳標本(細菌菌群或溶解後之菌群可以直接加入0.1﹪SDS液中load至gel上,注意要有一孔放蛋白質分子量標準液).(本實驗室使用者為8×10×0.5cm的mini gel,且為梯度gel,由4﹪~20﹪之acrylamide梯度).

3.     裝設Western blot設備, 注意戴手套, 以免手上手脂使蛋白質無法Blot至膜上.

其裝置如下圖示:


文字方塊: (紅頭) 文字方塊: (黑頭)使用14V, 4℃, 1~16hr可完成. 使用Electroblotting buffer.

3.     nitrocellulose paper放入Ponceau S solution 5min, 來將蛋白質染色, 在浸入水中destain 2min, 將此結果照相.

4.     將膜放在塑膠袋內, 加入blocking soluting(每10×15cm2大小的膜用5ml), 將袋封口, 緩慢振動30min, 再打開袋口一角, 倒去液體.

5.     Primary antibody稀釋(通常monoclonal antibodies稀釋1:1,000, 其他則稀釋1:100), 再以每10×15cm2膜用5ml來浸, 並緩慢振動30min.

6.     將膜由袋中取出(戴手套), 放入塑膠盆中, 以200ml PBS洗3次, 每次5min.

7.     稀釋HRPO conjugate(用blocking buffer).

8.     將膜裝入膠袋, 以5ml HRPO conjugate稀釋液浸30min.

9.     倒去HRPO conjugate液, 取出膜, 以200ml PBS洗3次, 每次5min.

10.將膜以當場配的DAB substrate液浸3min, (注意DAB液有致癌性, 小心使用).

11.照相存證.

各種溶液配方:

Blocking buffer

1g 即溶脫脂奶粉泡入100ml PBS中

Diaminobenzidine (DAB) substrate solution:

50ml 3,3-diaminobenzidine

2ml 1﹪CoCl2 in H2O

98ml PBS

0.1ml 30﹪H2O2 (在使用前才加入)

 (注意DAB有致癌性, 要小心使用)

Electroblottiny buffer (20mM Tris/150mM glycine, pH8)加14.5g的Tris base及67g glycine至4公升的dH2O中, 將pH調至8.0, 再加1,200ml的methanol, 再以dH2O使體積加至6公升.

Poncean S solution (0.5﹪Ponceaus S, 1﹪acetic acid):

0.5g Ponceau S

1ml glacial acetic acid

dH2O加至100ml

Horseradish peroxidase-anti-Ig Conjugate:

均向廠商採購, 並分裝0.025ml劑量待用.

附註:

Western Blotting技術相當敏感, 可偵測至1ng的antigen.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三十八、免疫分子生物技術

簡介:

人體內的細胞遇抗原時, 會受刺激繁殖, 而產生大量有專一性的抗體(monoclonal antibody). 而抗元常引起不同的B細胞產生抗體, 故在血液中的抗體實際上是多元性抗體(polyclonal antibodies), 其原因是此抗元常含有不只一處致抗體的部位(epitopes), 每個部位都可引起一個不同B細胞抗體.

抗體有五種, IgG, IgA, IgD, IgE及IgM, 對同一個人而言, 此5種抗體均對同一抗元有作用. 抗體的形狀如Y字形, 有二條輕鍊, 二條重鍊. 輕鍊又有K和λ二種, (但同一抗體只含其一), 但重鍊則只有一種. 即IgG是γ, IgA是α, IgD是δ, IgM是μ, IgE是ε.

不論輕, 重鍊均含有變異端(variable region)與恆常端(constant region), 與抗元作用的部分是在輕, 重鍊變異端的高度變異(hypervariable region)部分, 大約站15Å×20Å×15Å的空間大小.

抗體之所以能有如此多變化, 並非人的基因有如此大量, 而是在B細胞成熟過程中, 其基因重組(有很多恆常端, 變異端, 連接端, 變化diversity端的基因, 可以重組排列), 可以構成不同的抗體.

 

將酶銜接至抗體之技術

將酶銜接至抗體上, 是使酶(例如horweradish peroxidase HRPO, 或alkaline phosphatase)與抗體形成穩定的. 且不影響酶與抗體之功能.

HRPO銜接為例, 其化學變化如下:


 


 

此一技術, 可用於Enzyme-linked immounoworbent assay (ELISA)及western boltting, 其方法如下:

   

1mg/ml antibody solution

0.1M phosphate buffer, pH6.8

Horseradish peroxidase (HRPO)

0.1M Carbonate buffer, pH9.2

Sodium periodate (NaIO4) solution, freshly prepared

Sodium borohydride (NaBH4) solution, freshly prepared

Saturated ammonium sulfate (NH4)2SO4 solution

Tris/EDTA/NaCl (TEN) buffer, pH7.2

BSA

Glycerol

Dialysis membrane

Pasteur pipet fitted with glass wool

Sephadex G-25, medium

   

1.     1mg/ml抗體以2公升0.1M phosphate buffer pH6.8透析, 過夜,     4℃ 緩緩攪拌. (抗體量可以A280/1.44=mg Ig/ml來計算) (透析膜影    50﹪ethanol浸一小時, 再以10mM NaHCO3浸一小時, 再以1mM EDTA浸一小時, 再以dH2O沖洗, 再保存在phosphaed buffer中, 4℃, 為防細菌生長, buffer中可加入0.01﹪的sodium azide).

2.     10mg的GRPO於1ml的0.1M carbonate buffer, pH9.2中.

3.     0.25ml新配好的NaIO4液與0.25ml的10mg/ml HRPO/carbonate液混合, 蓋緊蓋子, 置室溫2hr(避免光照).

4.     在一支Pasteur pipette中放入適量glass wool, 將出口處以parafilm包好, 再將1ml以透析過的antibody液, 加入0.5ml的10mg/ml HRPO液中, 再將0.25g的Sephadex G-25加入此antebody/HRPO混合液中 (此一步驟可增進酶與抗體之結合). 將此混合物加入此Pasteur pipette中.

5.     置於暗室, 室溫3hr.

6.     將此Column以0.75ml的Carbonate buffer將conjugate洗出, 保存.

7.     在此釋出液中, 加入38μl的新配好之NaBH4液, 在室溫, 暗室, 置30min.

8.     再加入112μl的NaBH4液, 暗室, 置60min.

9.     再加入飽和0.9ml (NH4)2SO4液, 緩緩攪拌30min, 4℃, 離心15min, 10,000xg.

10.倒去上清, 將沉澱物溶於0.75ml的TEN中.

11.透析此液, 4℃, 2公升的TEN, 過夜, 第二天換過一次TEN液, 再透析4hr.

12.將透析膜內物取出, 加入適量BSA, 使此液中最終BSA量為20mg BSA/ml.

13.加入等量之glycerol並保存在-20℃.

 

配方:

0.1M Carbonate buffer, pH9.2:

1.36g Sodium carbonate

7.35g Sodium bicarbonate

950ml H2O

1M HCl或1M的NaOH調整pH至9.2再加dH2O使體積成為1公升.

0.1M phosphate buffer, pH6.8:

保存A溶液:0.2M:31.2g NaH2PO4於1公升的dH2O中

保存B溶液:0.2M:28.39g NaH2PO4於1公升的dH2O中

混合51ml的A液與49ml的B液, 及100ml的dH2O成為使用溶液.

飽和ammonium sulfate (NH4)2SO4液:

1.21g Tris base加入990ml dH2O中, 使成0.01M Tris液, 調整pH至7.0, 再加dH2O, 使總體積為1公升, 量767g的(NH4)2SO4加入此Tris液中,攪拌, 並加為熱, 使溶, 調整pH至7.0, 並保存在4℃, (NH4)2SO4的結晶會沉澱出來.

Sodium borohydride (NaBH4)液:

5mg NaBH4/ml dH2O, 必須用前才配

Sodium periodate (NaIO4)液:

1.71mg NaIO4/ml dH2O (用前才配)

Tris/EDTA/NaCl(TEN)液, pH7.2:

930ml dH2O中加入:

0.06g Tris base

0.37g Na2 EDTA

8.77g NaCl

調整pH至7.2(以HCl滴定)

dH2O使體積成為1公升

 

附註:

1.    使用此法, 約1ng/ml至10ng/ml的抗元可以偵測到.

2.    在使用時, 可將結果稀釋100至10,000倍. 是效果如何而定.

 

準備細菌抗元

   

E.Coli(長於培養液中)

Cell resuspending buffer

Lysozyme solution

Tris/EDTA/NaCl(TEN) buffer

10﹪SDS

8M urea  

   

1.     5ml的E.Coli液在桌面離心機離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 將沉澱細菌溶於5ml resuspending buffer中, 充分混合(Votex).

2.     吸出1ml細菌液入1.5ml的微量離心管中, 置冰上再加入0.2ml的lysozyme液, 待5min.

3.     離心3,000rpm, 5min, 保留上層, 將沉澱物以1.2ml TEN溶解之. (因為有些蛋白質是不溶於水, 故二者均應保留)

4.     在每一種樣本中各加入65μl的10﹪SDS, 置37℃, 10min, 此時樣本即可使用, 若不使用應冷凍保存, 若有必要可以8M urea液(4.8g urea加入10ml液中), 處理蛋白質.

配方:

cell resuspending buffer (10mM HEPES)

2.38g HEPES

dH2O或1 liter

附註:

1.     在免疫學實驗中, Enzyme-Linked Immunolorbent Assays(ELISA)是常用於偵測細菌或抗元的方法. 一般分為直接法, 即將抗元放入micro titer plate, 使附著在內壁, 再以diluting buffer使未被附著處能不接受抗體附著, 接者加入已銜接酶的抗體, 再洗去多餘的抗體, 再加入酶的作用物, 使產生反應.

另一種為間接法, 即先將抗體放入micro titer plate中, 使與內壁附著, 再以diluitng buffer處理, 使未被附著的壁不會接受抗元, 再加入抗原始與抗體作用, 再洗去多餘的抗體, 再加入已銜接酶的抗元, 再洗去多餘的, 再加入酶的作用物使產生反應.

直接法的缺點是想測的有專一性的抗元須與其他雜質互爭附於內壁, 以致有時量少, 而間接法則可選擇性的留下受測的抗元.

2.     至於抗體, 可以用抗元配合adjuvat一同注射入體中, 4週後再增強注射一次, 2週後再增強一次, 以後每次抽血前7天注射一次即可取得含此抗體的血液. 此血液經離心, 保存血清, 再以ammonium sulfate沉澱抗體(約33﹪的濃度即可沉澱出IgG), 再離心, 保存沉澱物, 再透析去鹽, 即可得抗體.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三十九、DNA-Protein交互作用的研究

許多基因功能控制受到與此基因中某一片斷與某特殊蛋白質的結合之影響, 為研究此種關係而研發出一些技術. 要研究此一主題, 首先必須先進行細胞核與細胞質中物質的抽提.

 

細胞核物質抽提

   

哺乳類動物細胞(可用組織培養細胞如Hela)

PBS

Hypotonic buffer

Low-salt buffer

High-salt buffer with 1.2M KCl

Dialysis buffer

Liquid nitrogen

玻璃製Dounce homogenizer

Dialysis membrane tubing (孔洞分子量≦14,000)

導電測量器

    (此方法均再4℃進行)

1.     需用5~10×108cells/liter的組織培養細胞, 以250ml離心管, 離心20min, 4,000rpm. (若為monolayer細胞, 應以塑膠刮刀將細胞刮下放入離心管中, 細胞要先以PBS洗過在刮下.) 倒去上清.

2.     估計沉澱物之大略體積, 加入體積量5倍的PBS, 混合後, 離心10min, 4,000rpm, 倒去上清.

3.     將沉澱細胞溶於hypotonic buffer(約沉澱體積5倍量), 離心5min, 4,000rpm, 倒去上清. 此一步驟動作要快, 以免細胞破裂損失抽提物質.

4.     加入原沉澱細胞體積3倍的hypotonic buffer, 置冰上10min, (此外原沉澱體積留在第二步驟時所得體積, 因在第三步驟時體積因細胞膨脹而增大了).

5.     將細胞倒入Dounce homogenizer, 上下壓榨細胞(處理時, 動作輕, 以免傷及細胞核).

6.     將均質後的細胞倒入離心管, 離心15min, 4,500rpm, 分開保留上輕與沉澱物二者. 上清用於抽提細胞植物, 沉澱物用於抽提細胞核內物質.

7.     估計沉澱物體積, 加入約體積1/2倍的low-salt buffer, 然後一邊攪拌, 一邊一滴一滴加入high-salt buffer, 直到約1/2的沉澱物體積為止.

8.     緩緩振動, 30min, 再離心15,000rpm, 30min, 上清液就是核內粹取液.

9.     將粹取液放入透析膜內, 以50倍液透析, 直到可以導電器量出袋內外之導電度相同為止. (2ml以下量約1hr, 100ml約5hr)

10.取出粹取物, 離心15,000rpm, 20min, 保留上清. 用小量測蛋白質濃度, 其餘保存在-70℃.

 

接著將前述步驟6中的上清物, 用來提取細胞質粹取物.

   

10x cytoplasmic extract buffer

   

1.     取細胞質(上清液)量0.11倍體積的10x cytoplasmic extract buffer加入混合.

2.     離心16,000rpm, 1hr, 將上清液倒入透析膜內, 至膜內外導電度相同為止.

3.     取出粹取物, 離心15,000rpm, 20min, 保留上清, 保存於-70℃.

 

配方:

10x cytoplasmic extract buffer:

0.3M HEPES, pH7.9, 4℃

1.4M KCl

0.03M MgCl2

Dialysis buffer:

20mM HEPES, pH7.9, 4℃

20﹪glycerol

0.2mM EDTA

0.2mM PMSF (phenyl methylsulfonyl fluoride)

此化合物溶於isopropanol, 應先調0.2M的儲存液備用, 在使用前才滴入.

0.5mM DTT (Dithiothreitol)

必須使用前才加入.

High salt buffer:

20mM HEPES, pH7.9, 4℃

25﹪glycerol

1.5mM MgCl2

0.8, 0, 1.2, 1.4或1.6M KCl (用於測試何種濃度下可萃取最高量的物質, 若無足夠時間, 取1.0或1.2M試之)

Hypotonic buffer:

10mM HEPES, pH7.9, 4℃

1.5mM MgCl2

10mM KCl

0.2mM PMSF (使用前加入)

0.2mM DTT (使用前加入)

Low salt buffer:

配方同high salt buffer, 而KCl用0.02M即可.

附註:

1.     以此方法測得結果約8mg/ml細胞蛋白質.

2.     DNA-Protein交互作用研究, 方法為將核或細胞質提取之蛋白質與想研究的DNA片斷結合, 並以電泳處理, 受結合的DNA會跑得慢. 另外, 亦可以Dnase I處理, 凡有結合的DNA不受切割, 方法很多, 容後再介紹.

四十、酵母菌基因工程技術(Saccharomyces cerevisiae Biotechnology)

酵母菌是真核細胞基因工程的基本研究工具, 有如E.Coli之於原核細胞一般.

酵母菌(baker's yeast)在培養液中, 約90分鐘分裂一次, 且在有氧, 無氧環境均可成長.

酵母菌有16個直線型染色體(單套), 最小的200Kb, 最大的2,200Kb, 且有關染色體複製的起始點(Origins of replication) (ARS elements), 中心粒(centromeres, CEN elements)及末端段(telomeres)均已被嫁接出來. 其telomeres含有5dG-3dT3的重複片段.同時人工染色體也由此倍製造出來, 而且也設計成可以在E.Coli及yeast中均可成長的shuttle vectors(巴士嫁接媒介).

酵母菌可分成α或a型, 單套酵母菌可分泌α或a蛋白質來誘導"交配"成雙套.

酵母菌有的也含有質體, 有的亦含有病毒.

酵母菌的成長, 在培養液中達到5×107cells/ml~2×108cells/ml為飽和, 通常用YPD(teast extract, peptone, dextrose)或稱YEPD medium.

YPD medium配方:

每公升含10g teast extract

20g peptone

20g dextrose

保存teast, 可用每支含1ml的30﹪glycerol(消毒過)試管, 加入1ml yeast液, 保存在-70℃, 或1ml yeast液中, 加入80μl的DMSO, 保存在-70℃.

 

 

以紫外線取得酵母菌突變種

   

YPD medium及plates

選擇mutants的plates(自行設計)

或以溫度選擇temperature sensitive metants

UV燈(使用UV燈時應戴安全眼鏡)

   

1.     將一種yeast長在5ml YPD medium中過夜, 30℃振盪300rpm.

2.     1.5ml yeast液, 以微量離心機, 最高速離心5sec, 倒去上清, 再以dH2O(消毒過)洗2次. 之後將細胞溶於1ml dH2O中.

3.     OD600, 若介於2.5~3.0, 則細胞述大約為8×107cells/ml, 將細胞逐次稀釋置2,000cells/ml, 再以0.1ml塗皿.

4.     將塗有Yeasts的皿(保留2個為對照組), 置UV燈下, 照使達300eg/mm2, 再放室溫, 長3天. 對照組為測其生存之用.

5.     取消毒過的圓形濾紙,  做replica-plate, 將一個皿放室溫, 一個放37℃, 長3天. 凡在室溫有長而37℃不長的可能就是temperature sensitive colonies, 此一步驟或以抗藥性來選出抗藥性突變種亦同.

 

 

Yeast的嫁接媒介

有些yeast的嫁接媒介(cloning vector)為plasmids, 稱為YRP(yeast replicating plasmids), 其中含有yeast DNA複製起始點的片段基因, 稱為ARS(autonomous replication sequences), 但這種plasmids在繁殖過程中常不能保存在新的細胞中, 若在此plasmids中加入Centromeres(CEN elements), 而形成YCP(yeast centromeric plasmids), 就可使其穩定性增加.

另有YEP(yeast episomal plasmids), 是由yeast的plasmid所構成. 還有YLP(yeast linear plasmids)是直線型的, 因含有telomeres, 還有yeast artificial chromosome(p YAC), 可供嫁接約400Kb的DNA. 此plasemid並可長在E.Coli中.

在這些嫁接媒體中, 為便於檢測特定基因的功能, 常在此特定基因加上Lac 2 gene, 此基因係因E.Coli中得來, 會產生β-galactosidase, 當此  遇到一些類似β-galactosides物時, 會分解之而產生有顏色的分解物, 很容易偵測. 為使此基因能在yeast中運作, 在此基因前需先加上yeast的promoter region, 以下介紹一種測β-galactosidase量的方法.

此法是基於含此基因的yeast, 長於培養液中, 加入ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactoside), 使在30℃作用, 再以滴定使pH達11終止反應, 再以光譜儀測色度變化而計算β-galactosidase的量.

   

YPD培養液

Z buffer

0.1﹪sodium dodecyl sulfate (SDS)

chloroform

4mg/ml ONPG in 0.1M KPO4, pH7.0 (過濾消毒, 保存-20℃)

1M NaCO3

30℃ Water bath

 

   

1.     以一個菌群的純yeast接種於5ml的YPS液中, 過夜(可做二, 三個菌群以便比較).

2.     以過夜培養的yeast液50μl接種無菌的YPD液5ml, 使長至OD=2.0(大約0.5~1×108cells/ml).

3.     離心2,500rpm, 5min, (桌上型離心機), 將沉澱物溶於等量Z buffer中. (如果β-galactosidase量不多, 可以溶於較少量的Z buffer中).

4.     由上述步驟中之yeast, 取出二個樣本, 一為100μl細胞加900μl Z buffer, 另一為50μl細胞加950μl Z buffer.

5.     在每一樣本中各加入1滴Chloroform及2滴0.1﹪SDS液, vortex 10sec, 再放入30℃水浴中15min.

6.     在每一樣本中加入0.2ml的4mg/ml ONPG, vortex 5sec, 並於30℃水浴中, 並開始計時.

7.     發現有黃色出現時, 加入0.5ml的1M Na2CO3並記下時間.

8.     離心5min, 2,500rpm, 在測上清液的OD420與OD550(若上清液中不含細胞破裂物, 則OD550通常為0, 可以不計算).

9.     依下列公式計算β-galactosidase的量(單位unit, U)

 

 

1,000×OD420(1.75×OD550)

 
 

t×V×OD600

 
U=

 

 

t=作用時間(min)

V=使用於測定的培養液量(ml)

OD600=用於測定之細胞量

OD420=O-nitrophenol的吸光量及細胞破裂物的折光量

OD550=細胞破裂物的折光量

 

配方:

Z buffer:

16.1g NaHPO4, 7H2O (60mM最終濃度)

5.5g NaHPO4, H2O (最終濃度40mM)

0.75g KCl (10mM最終濃度)

0.246g MgSO4, 7H2O (最終濃度1mM)

2.7ml β-mercaptoethanol (50mM最終濃度)

調整pH至7.0, 再以dH2O加至1公升, 不要高溫高壓消毒.

附註:

當β-galactosidase分解ONPG成為O-nitrophenol與galactose, 而前者為黃色, 可以OD420測出. 而當所投入的ONPG量多時, 此反應與酶的量有相同性.

 

酵母菌基因轉植

目前將基因轉植入yeast中, 主要有電子槍, 電極, lithium acetate及spheroplasts等法, 此處僅介紹lithium acetate法. 此法是基於陽離子可使yeast的細胞膜能使DNA透過, 在加入DNA後, 再加入polyethylene glycol(PEG), 再塗在選擇性的培養皿上.

 

   

YPD medium

TE buffer

Lithium autate solution

5mg/ml carrier DNA (sheared E.Coli DNA)

PEG solution

含選擇性化學品的培養皿

   

1.     將純化的單一菌群yeast加入2ml YPD液中, 在30℃成長一晚.

2.     將細胞稀釋至OD600=0.2(約3×106cells/ml)取50ml YPD(含上述量之yeast)於250錐形瓶中使長4hr, 30℃, 使達OD600=0.5~1.0(約1~2×107cells/ml), (使用時約10ml可做一個實驗).

3.     將細胞轉入無菌離心管, 離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 將細胞溶在10ml的lithium acetate液中.

4.     再離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, μl的lithium acetate液中.

5.     將細胞符懸液轉入一支消毒過的13×100ml試管置30℃, 輕輕振盪50rpm, 1hr.

6.     100μl的上述細胞浮懸液加入微量離心管中(一共可有5支), 除控制組那支外, 其餘各加入10μg的Donor DNA及20μg的carrier DNA(保總體積不要多於15μl). 對控制組則只加入carrier DNA, 將液體以pipettor上下抽吸混合. 置30℃, 30min.

7.     每支試管加入0.7ml PEG液, 以手指輕彈試管混合之, 置30℃, 45min, 再置42℃, 5min.

1.     將每試管內吸出200μl塗選擇性平盤, 置30℃, 2天, 可看結果.

2.     將再選擇性平盤上的分離菌種, 取數個, 分別培養於培養液中, 以便保存.

配方:

lithium acetate solution:

0.1M lithium acetate

10mM Tris.Cl, pH8.0

1mM EDTA

以過濾消毒

PEG solution:

40﹪(w/v) PEG3350

0.1M lithium acetate

10mM Tris Cl, pH8.0

1mM EDTA

過濾消毒

附註:

此種方法可得約每μg DNA, 有1~10個細胞可轉植成功.

 

 

抽提酵母菌DNA

以下介紹以Zymolase處理yeasts, 使成為spheroplasts, 再以SDS使破裂, 再以potassium acetate將SDS, proteins及cellular debris沉澱, 而核酸則保留在上清液中, 這種方法來抽提yeast的DNA.

 

   

YPD medium

Sorbitol solution

0.3mg/ml Zymolase (20,000U/g) in sorbitol solution

0.28M β-mercaptoethanol

Tris/EDTA solution

10﹪SDS

5M Potassium acetate

100﹪ethanol

TE buffer

1mg/ml RNase A

100﹪isopropanol

15ml 離心管(用過即棄式)

30℃及37℃振盪培養相

65℃水溶器

 

   

1.     15ml無菌離心管中, 培養5ml的純yeast菌種(由單一菌群接種),  30℃, 振盪培養24hr, 350rpm, 此時細胞數約1~2×108cells/ml.

2.     離心3,000rpm, 5min, 將上清液吸除.

3.     加入0.5ml sobitol solution, 充分混合.

4.     加入5μl的0.3mg/ml zymolase in sobitol solution, 以及50μl的0.28M β-mercaptoethanol, 充分混合(votex), 置37℃, 1hr, 振盪200rpm.

5.     離心3,000rpm, 5min, 吸除上清, 加入0.5ml Tris/EDTA液, 將液體吸上吸下以充分混合, 再將全部液體(即細胞浮懸液)轉入1.5ml的微量離心管中.

6.     再加入50μl的10﹪SDS液, 緩緩混合, 置65℃, 20min.

7.     再加入200μl的5M potassion acetate, 緩緩混合, 置冰上30min.

8.     離心10,000rpm, 3min.

9.     將上清液轉入另一離心管中, 再加入100﹪ethanol置離心管, 緩緩混合. (此時DNA會出現)

10.離心10,000rpm, 10sec, 沉澱DNA, 倒除上清, 將DNA溶於300μl TE中.

11.加入50μl的1mg/ml Rnase A, 充分混合, 置37℃, 1hr.

12.加入0.5ml的100﹪isopropanol, 緩緩混合, 至DNA沉澱出來.

13.DNA以微量吸管尖頭取出, 並轉入另一新離心管中, 加入125μl的TE buffer.

 

配方:

Sorbitol solution:

0.9M sorbitol

0.1M Tris,Cl, pH8.0

0.1M EDTA

Tris/EDTA solution:

50mM Tris,Cl, pH8.0

20mM EDTA

 

附註:

在抽提yeast DNA時, plasmids也會一同析出, 其量大約是yeast DNA量的1/1,000, 亦即在2ml的yeast cells可提出約4μg的DNA, 而其中plasmids約有4ng, 可直接用來轉植. (只要用0.1μg的DNA即可, 其中約含0.1ng的plasmeds)

 

 

 

 

 

.四十一.基因植入動物細胞技術

此處緊介紹最常用的方法, 並以組織培養之單層細胞為標的.

組織培養動物細胞, 應注意無菌技術, 為求初學者溶液著手, 以Hela細胞, 即可高溫高壓消毒的MEM培養液開始, 加入10﹪的牛血清. 並加入Gentamicin sulfate(抗生素), 以防污染. 在細胞剝離培養器時, 採用0.5﹪w/v的trypsin即0.2﹪w/v的EDTA液, 所有的培養液, 在使用前, 必須先抽出少量, 先在CO2恆溫培養相中培養至少2天, 無污染出現, 才能使用. 在從事基因植入動物細胞技術前, 應先熟悉動物組織培養, 即生長曲線為必要之練習. 每4小時, 由12圓隔培養盤中, 取出一隔之細胞計數, 至72小時為止. 藉此練習來熟悉無菌即培養技術.

Calcium Phosphate沉澱DNA於HEPES緩衝液中並使DNA植入動物細胞法:

   

生長期Hela細胞

培養液

質體DNA(含能在動物細胞中表現之可探測基因)(每次轉植需10~50μg DNA)

2.5M CaCl2

2x HEPES-buffered saline (Hebs)

[配方]16.4g NaCl

11.9g HEPES acid

0.21g Na2HPO4

800ml dH2O

5N NaOH調整pH至7.05

0.45μm濾膜過濾消毒, 分別用50ml量保存在-20℃

注意:此時必須將0.5ml之2xHeBS與0.5ml之250mM CaCl2混合, 看有否沉澱發生, 如無很細的沉澱, 則效果不佳.

Phosphate-buffered saline (PBS)

[配方]  10X保存液配方:

80g NaCl

2g KCl

11.5g Na2HPO4 7H2O

2g KH2PO4

1X的使用液配方:   (pH約為7.3)

137mM NaCl

2.7mM KCl

4.3mM Na2HPO4 7H2O

1.4mM KH2PO4

37℃, 5﹪CO2恆溫培養箱

10cm組織培養皿

15ml無菌conical tube

   

1.     在轉植前一日, 將細胞接種入培養皿, 約1:15比率稀釋完全滿佈的細胞, 加入9ml培養液.

2.     將要轉值得DNA, 以酒精沉澱, 並晾乾, 再溶入450μl的無菌蒸餾水中, 再加入50μl之2.5M CaCl2. (此處以酒精沉澱DNA的目的在消毒)

3.     在一個15ml的conical tube中加入500μl的2X HeBS, 此時一面以一個無菌1μl吸管向此液中打氣, 一面一滴滴的加入DNA/CaCl液, 加完後立即votex 5秒鐘.

4.     置室溫20min.

5.     將此DNA沉澱液均勻分布在組織培養皿之細胞上.

6.     培養6小時, 倒去培養液, 以5ml之1X PBS洗細胞2次, 再加入10ml培養液.

7.     若為暫時性的轉植, 隔日即可取下檢測. 若為培養穩定之轉植細胞, 則令細胞長二次分裂的時間, 在保存之.

預期結果:約10﹪的細胞可被轉植.

附註:

為能偵測基因有否植入細胞, "可探測基因"如β-galactosidase, 或螢火蟲之luciferase基因均可使用.

在此之前, 本手冊層介紹將基因轉植入細菌的方法, 當時所使用的為快速簡易法, 但基因植入的成功率極低, 此外也已介紹CaCl2法, 在此一並將使用CaCl2來轉植細菌的方法列出, 供參考:

 

   

LB培養液

E.Coli純菌

CaCl2

[配方]60mM CaCl2

15﹪glyerol

10mM PIPES, pH7.0 (如無PIPES, 則取上二種材料配製)

可高溫高壓消毒.

LB培養皿含ampicillin

Plasmid DNA

   

1.     將此菌E.Coli接種於50ml LB液中, 過夜37℃, (250rpm)振盪培養.

2.     取上述E.Coli 4ml, 加入有400ml LB液之1 liter錐瓶, 37℃, 250rpm, 培養6小時.

3.     (2)中的E.Coli分裝在離心管中, 每支50ml, 並置冰上10min, 再離心5,000rpm, 5分鐘, 4℃.

4.     將細菌沉澱再溶於10ml, CaCl2液中, 再於4℃, 5,000rpm, 5min.

5.     再將細菌沉澱溶於10ml CaCl2液中, 置冰上30min, 再4℃, 離心5,000rpm, 5min.

6.     再將E.Coli溶於2ml CaCl2液中, 再分成250μl至微量離管中. 並保存在-70℃, 待用.

7.     取一支圓底離心管, 置冰上,加入10至25μl之plasmis DNA約10ng, 取出冷凍於-70℃的細菌, 快速在37℃解凍, 取出100μl加入含DNA的離心管中. 置冰上, 10min.

8.     將此離心管轉投入42℃水溶中, 2min, 加入1ml之LB液, 再放37℃, 250rpm, 1hr.

9.     將此轉植過的細菌, 稀釋數次, 每次以玻棒塗平盤法塗在恆溫培養箱, 至第二日檢視結果.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.四十一.使用基因槍轉植基因

注意事項:

1.     切勿將槍口對人.

2.     事前備妥polyvinylpyrollidone(MW=360,000,100g約750元), Spermidine(Sigma #S-0266, 5g約3,500元). 99.9﹪酒精. 15ml與1.5ml離心管, 0.05M Spermidine, 1M CaCl2, 20mg/ml polyvinylpyrollidone (溶於酒精) 使用前取少量稀釋成0.1mg/ml, 準備3.5ml以供50發子彈用,

3.     50發子彈,  用35mg金粉  (直接置入離心管測),  100μg DNA (濃度>1μg/μl). 管子長76cm. 以3.5ml液狀充填.

4.     子彈準備架左方有2個小膠圈(O-rings), 及槍噴口有1個小膠圈, 用久磨損須更換.

 

      (每50發子彈用)

1.     35mg金粉(直接置入1.5ml離心管測), 加入100μl之0.05M Spermidine, vortex 5sec, sonicate 10sec.

2.     加入100μg DNA(若同時轉植1種以上基因, 等量加入), vortex 5sec.

3.     加入100μl 1M之CaCl2, 以低速vortex 5sec, 再置室溫使沈澱10min, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清,

4.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清, 如此, 重覆3次, 吸除上清.

5.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再於15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex此15ml離心管5sec, 此時可將此管保存於-20℃. 或接下列步驟.

6.     將子彈準備架安置好, 並通入N2, 將76cm子彈管由右側插入, 直通至左側環內1cm, 將氮氣開關調至0.3~0.4, 並吹氣入管15min.

7.     關掉氮氣開關, 將管取出, 將一端插入接有軟接頭的10ml針筒管, 將子彈管另一端置入含3.5ml黃金粉, DNA的液體中(此液體需先以低速vortex 10sec, 兩sonicate 30sec, 並立即使用), 以針筒吸取液體至子彈管長64cm處, 將子彈管取出, 但是再以針筒吸子彈管中液體, 使子彈管兩端均留下約6cm空白, 立即將子彈管插入準備架, 並等5min, 使金粉粘在管壁, 再以針筒以2cm/sec的速度將子彈管中酒精吸除.

8.     取下針筒, 將準備架旋轉開關打開, 使轉動30sec, 再打開氮氣, 使子彈管乾燥5min, 關氮氣, 停轉, 將子彈管取出.

9.     檢查子彈管, 看金粉是否均勻分佈, 將不良部份以簽字筆註記, 以便切成子彈時棄之.

10.將子彈保存盒(含乾燥劑)置切子彈器下, 將子彈管插入切子彈器, 開始切子彈, 完成後將子彈保存盒標示清楚, 蓋好, 並以parafilm封好, 保存於4℃. 在使用前將子彈裝入彈夾, 將彈夾以"12"向上裝至定位.

11.將氦氣接好, 調至400psi, 最大至600psi, 準備射擊. 射擊後, 取下彈夾, 關氦氣總開關, 將氦氣調節閥逆時針轉, 排氣, 再拆下接管.

12.若射擊動物附著細胞, 吸除培養液後為之, 浮懸細胞則以5×107cells/ml濃度, 取20μl, 滴於培養皿上, 使分佈直徑小於1.5cm, 若射擊動物皮層, 先剃去毛, 用70﹪酒精消毒後為之.

 

 

若要以RNA取代DNA, 則不用CaCl2, 與polyvinylpyrollidone而用5M ammonium與2-propanol來將RNA附在金粉上. 其步驟類同處理DNA.

簡述如下:

1.     35mg金粉, 加入液體mRNA, (5μgRNA/mg金粉), 加入液體mRNA體管1/10量的5M ammonium與2倍量的2-propanol, vortex 15sec, 離心離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

2.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

3.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

4.     將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

5.     將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再於15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex 此15ml離心管5sec, 此時可將此管保存於-20℃. 即成.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

四十二、使用ABI 310型核酸自動排序儀

做排序用

說明:

1.     此儀器採雷射光偵測在毛細管電泳中, 不同顏色標定之ddNTP核酸合成中斷法之顏色, 而以電腦軟體判讀排序. ABI 310在使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit時, 採E型濾光模式偵測.

2.     目前本校採購本ABI 310型核酸自動排序儀的美商應用生命科學儀器公司有2種套組供核酸自動排序儀使用, 其一為ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 另一為ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0. 其中v2.0用於較長段的核酸排序, 但2者的protocol 完全相同, 均可用於單股, 雙股, PCR成品等之排序之用, 採購時以v2.0為佳.

3.     上述kits中, Taq polymerase, buffer等均己混在一起便於使用.

4.     若需軟體部份, 可由http://www.pebio.com/ab/techsupp/310.html download.

5.     ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq FS v2.0, 分別有可使用100(採購編號#4303149)次, 或1,000(#4303150)次等多種. 可依用量選購, 此Kit應保存於-20℃.

6.     template的使用量上,參考下表:

PCR product(必須純化):

100~200bp 1~3ng

200~500bp 3~10ng

500~1000bp 5~20ng

1000~2000bp 10~40ng

>2000bp 40~100ng

Single-stranded DNA 50~100ng

Double-stranded DNA 200~500ng

Cosmid or Bacterial artificial chromosome (BAC) 0.5~1.0μg

Bacterial genomic DNA 2~3μg

7.     整個排序用樣最終體積為20μl, 包括8μl DNA template, 4μl primer, primer的濃度為0.8pmol/μl, 若將primer的濃度提高為4.2pmol/μl, 則可只用1μl, 而template則可用到11μl. 另8μl為Cycle sequencing mix.

8.     本儀器軟體均已由廠商代為裝妥, sequencing data collection於電腦開機即可使用, 在分析時則另以分析軟體行之. 有需校對儀器時, 可用ABI 310 diagnostics system軟體, 對整個儀器校對約需9min. 排序完成後, 可用Factura Identification Software整理結果.

 

執行plasmids 與PCR products的sequencing步驟:

先執行Cycle sequencing, 在本校的RoboCycler 40型thermal cycler執行. 用0.5ml的離心管, 加入:

Terminator Ready Reaction Mix 8.0μl

Template 如說明5

Primer如說明6

3項合計20μl,若不足,加去離子水.

1.     充分混合後, 離心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.

2.     然後進行反應96℃ 30sec, 50℃ 15sec, 60℃ 4min, 25cycles. 然後取出, 離心3000rpm, 5sec.

3.     再進行純化(使用Bio-Rad Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns 步驟為先將column中的resin緩速vortex 10sec, 將底部帽取下, 將column置入1支2.0ml離心管中, 離心750xg, 1min, 再將column置入1支1.5ml已高溫高壓消毒過的離心管, 將要純化的DNA吸入管中, 離心750xg, 2min, (速度不可太高, 時間不可超過2min) 所得即為純化DNA).

有關xg換算為rpm的參考公式如下:

xg=1.12×105×r

(r為由軸心至離心管正中間之半徑cm值×rpm2)

       

xg=11.18×r×(rpm/1000)2

若為BAC DNA,則用0.5ml的離心管,加入

Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl

Template 如說明5

Primer 5~10 pmol

3項合計40μl, 若不足, 加去離子水.

1.     充分混合後, 離心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil. 然後進行反應25 cycles.

2.     然後取出, 離心3000rpm, 5sec.

3.     再進行純化.

 

若為Bacterial Genomic DNA, 則用0.5ml的離心管, 加入:

Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl

Template 如說明5

Primer 6-13 pmol

3項合計40μl, 若不足, 加去離子水.

1.     充分混合後, 離心3000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.

2.     然後進行反應25 cycles. 取出, 離心3000rpm, 5sec.

3.     再進行純化.

若無Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns,可採沈澱純化法:

(1).   PCR的結果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.

(2).   再加入80μl 75﹪isopropanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13,000rpm, 20min, 將上清液吸除.

(3).   加入250μl 75﹪isopropanol, 緩速vortex 10sec, 離心13,000rpm, 5min, 將上清液吸除.

(4).   將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.

亦可採用酒精沈澱法:

(1).   PCR的結果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.

(2).   再加入16μl去離子水, 64μl 95﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13,000rpm, 20min, 將上清液吸除.

(3).   加入250μl 70﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 離心13000rpm, 5min, 將上清液吸除.

(4).   將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.

亦可採用酒精與醋酸鈉沈澱法:

(1).   PCR的結果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.

(2).   再加入2μl的3M sodium acetate, 50μl 95﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13000rpm, 20min, 將上清液吸除.

(3).   加入250μl 70﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 離心13,000rpm, 5min, 將上清液吸除.

(4).   將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.

 

使用ABI 310排序儀:

1.     將前所得樣本溶於25μl的Template Suppression Reagent(TSR)中(隨polymer提供), 緩速vortex 15sec, 離心1000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 並立即置冰上, 待用.

2.     要用多少樣本量與DNA模子的品質, 引子功能等均有關, 但最少需要10μl. 將樣本(>10μl)吸入0.5ml管中, 蓋上塞子. 緩速vortex 15sec, 離心1,000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 並立即置冰上, 待用.

3.     將準備好的tubes置機器之樣本管架上, 並在紙上記下每支管之樣本名及排列位置.

4.     ABI 310 用performance optimized polymer 6(POP-6此6代表6﹪)做為毛細管電泳材(採購編號P/N[part number] 402844其中包括2瓶TSR). 在GeneScan時用POP-4(4﹪)(P/N 402838)及10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA (#402824)(使用時稀釋為1x).

5.     毛細管可至少供100次樣本用, 不用時需洗淨並將兩頭浸入deionized water中. 毛細管的窗戶部份不應手握, 有灰可以酒精擦拭.

6.     run 600-base, 用61cm毛細管(粉紅色註記), 用Seq POP6 E run module, 200v/cm, 約120min. 若run 400-base, 用47cm毛細管(綠色註記), 用Seq POP6 Rapid E run module , 320v/cm, 約35min. 溫度均為50oC. 以上均用1ml針管, BD set any primer. 並使用CE-1 basecaller.

7.     pump block以自來水洗淨, 再以dH2O沖洗, 以吹風機風乾, 用1.0ml玻璃針筒緩緩吸0.2ml POP-6, 將針桿抽吸數次, 再緩緩吸入0.5ml POP-6, 若有氣泡必須將針筒直立待汽泡上升, 加以排出.

8.     再以蒸餾水清洗針筒外部, 並以Kimwipes擦乾, 將針裝於定位, 關緊廢料口, 並旋緊左側上方供裝塑膠針筒的Luer valve, 裝好毛細管, 毛細管左瑞正好在針筒下出口之前, 旋緊毛細管接頭, 毛細管另一端(右瑞)須超過細鐵柱0.5mm, (細鐵柱先以dH20擦淨, 擦乾). 視窗處通過laser光眼, 關好黑色蓋, 其餘部份以黃色耐熱膠布貼在白色加熱板上.

9.     Turn on儀器, 由電腦中選"about collection software", 在Manual control window點Function pop-up menu, 再點autosampler present tray再點execute, 此時autosampler tray會退出, 將samples置於tray上, 再選Function, 點autosampler return tray, 再點execute, tray就退回定位, 即可將右側門關上. 再選Instrument視窗, 點Change capillary, 按reset, 使injection counter為0.

10.此時, 取13.5ml dH2O+1.5ml 10x running buffer混勻, 加入buffer valve chamber至紅線處, 再加入vial 1至黑線處. 將有紅線之玻璃小杯裝妥, 將vial置tray之位置1, 置另一含dH2O之vial 2於位置2, 均加上有孔蓋, 再取1去蓋1. 5ml離心管裝dH2O置位置3.

11.此時設定Syring Max Travel值, 在電腦上選Manual control window, 選Function, 再選Syring Home, 再按execute, 再選Syring Max Travel, 點Syring down, 按execute, 每按1次, toggle會向下一點, 按至toggle與針桿相接即停, 再選Syring up, 輸入250值再按execute.

12.再選Buffer valve close, 按execute, 將玻璃針筒下方接頭略鬆一點, 將針桿推一點, 使下方接頭之白色管頭現出1滴polymer以去除空氣, 再將下方接頭旋緊. 再選buffer valve open, 按execute, 將針桿推一點使polymer充填至左側上方接頭之下近斜坡管處, 再選buffer valve close, 按execute, 再選Syring down, 按execute, 可多按几次, 使polymer充至斜坡管內滿為止. 再由function中選temperature, 設定為50℃, 按execute.

13.此時選Autosampler calibration, 按start, 再按ABI 310機器左側之tray鍵, 使tray移動一下, 選autosampler home x, y, axis, 再按execute, 再選autosampler Z axis, 再按execute, 再選syring home, 按execute. 關上機器所有之門.

14.File項選new, 再選sequence sample sheet 48 tubes, 輸入sample名稱, quit此window, 再按save, 第2次再按save. 再由file, 選new, 再選sequence injection lift, 選sample sheet, 選出方才建的檔名, 再選A1-1即第1行第1格. 此時選Edit, 再選insert, 選一個名稱, 按綠色箭頭即run. 儀器自動run至結束. 若再續run, 先quit injection lift, 再save, 再選autosampler present tray 按execute, 取出舊samples, 放入新samples, 再按return tray, 再選syring home x,y,..依前述步驟.

15.分析Data, 用sequence analysis, 選add file, 再選ABI 310, 按ABI Prism 310, 按open, 按runs, 再按open, 選所要的file, 按open, 選要分析之sample, 按add file, 再按done, 再按start, 按sample file之名, execute, 即可看結果, 再按P, 按start, 即可印出.

 

 

做掃瞄比較(Gene Scan)用

使用Fluorescent Genotyping Demonstration Kits A(#402246)或B(#402247), Kit A可amplify PCR products, Kit B則用於業已經PCR amplified 之樣本.

另須Fluorescent Amidite Matrix Standatds (#401546)

Deionized formamide

filter-sterilized deionied water

若用Kit B則尚須GeneScan-350 size standard(#401736)

ABI Prism 310 10x Genetic Analyzer buffer with EDTA (#402824)

POP-4(#402838)等材料.

在將機器由做排序轉換為掃瞄用時, 須先將毛細管, gel block, 玻離針筒均洗淨, 重裝. 並準備好1x之Genetic Analyzer buffer with EDTA 50ml.

注意:

gel block絕不可以任何有機溶劑處理. 全程須帶手套. 充填gel方式同排序步驟, 只是gel為POP-4.

1.     由電腦中選About collection software, 由window中選Perferences, 再選Sequence injection list Default, 或GeneScan injection List default, 若電腦要求則輸入139115, 按OK, 再選Collection Software一次.

2.     Manual Control window之Function項, 選Syringe Home 按execute, 再由Function項中選Syringe Max travel, 記下所顯示數據, 再按Syringe Down, 輸入前項所顯示數據, 按execute, 在針桿推進器與針桿相接時, 停止, 由window中選Status.

3.     injection項下記下數據, 將此數據減15, 再選Syringe Max Travel, 將上述減去15之數據輸入, 按execute, 將數據抄在儀器左側門內.

4.     再選Syringe Up, 輸入250, 按execute, ……其餘裝毛細管, 裝gel, 裝樣本方式均同做排序方式, 然後, 由Instrument項選change capillary, 在Reset項按OK, 使injection counter設為0. 再由Manual control中選temperature輸入60℃, 按execute.

準備樣本:

1.     準備14支0.5ml離心管, 分2列, 每列8支, 每列第7與第8支單獨放, (簡寫為A1~A8, B1~B8)

2.     Kit A置冰上解凍, 將第1列之A1~A6及第2列B1~B6各支中, 各加入9μl Reagent mix, 再加3μl之control DNA 1347-02於A1~A6中, 再於B1~B6中各加3μl Control DNA 1347-10.

3.     A1,B1中各加3μl D12S83-[FAM].

4.     A2,B2中各加3μl D7S517-[FAM].

5.     A3,B3中各加3μl D2S391-[TET].

6.     A4,B4中各加3μl D13S171-[TET].

7.     A5,B5中各加3μl D1S220-[HEX].

8.     A6,B6中各加3μl D3S266-[HEX].

9.     然後每支中各加40μl mineral oil, 蓋好管蓋, 離心1500rpm, 15sec.

10.再進行PCR, 95℃, 12min, 1 cycle.

11.94℃, 15sec, 55℃, 15sec, 72℃, 30 sec, 10 cycles.

12.89℃, 15 sec, 55℃, 15 sec, 72℃, 30sec, 20 cycles.

13.final extention 72℃, 30min, 保存在4℃.

14.之後由A1, A2中各取7.5μl, A3, A4中各取5μl, A5, A6中各取10μl, 置入A7中.

15.同樣將B1, B2中各取7.5μl, B3, B4中各取5μl, B5, B6中各取10μl, 置入B7中.

16.再由A7中取1μl置入A8, 由B7中取1μl置入B8. (若使用Kit B則各為2μl).

17.然後方子A8, B8中各加入formamide size standard mix 12μl. 將A8, B8離心1,000rpm, 15sec, 置95℃, 5min, 置冰上.

 

準備deionized formamide:

1.     50ml加5g ion-exchange formamide resin(AG501×8 from BioRad), 攪拌30min, 以試紙測pH若在7~9之間則可.

2.     deionized formamide以2 micron濾器過濾, 分500μl保存-20℃. 若在7~9之間則可

3.     formamide吸入另一加有5g ion-exchange之燒杯再攪拌30min, 以試紙測pH若在7~9之間則可, 分500μl保存.

準備formamide size standard mix:

1.     5μl size standard+12μl deionized formamide, 緩速vortex 5sec, 離心1000rpm, 15sec, 保存於4℃.

準備Matrix standard samples:

1.     1μl matrix standard+12μl deionized formamide, 緩速vortex 5sec, 離心1000rpm, 15sec, 保存於4℃.

Denature Matrix standard samples:

1.     sample置95℃ 5min, 再置冰上待用.

2.     然後, 將上述樣本依A7, A8, 及4种matrix standard samples分別置autosampler tray上的右起第1排之1~6位上. 而Kit B的樣本置另一tray上排列方式比照.

3.     再準備Genescan sample sheet, 依Kit A或B分別設定, 再設定Genescan injection list, 機器會自動執行每樣本1次, 若要多於1次, 要重覆設定, 在第1樣本前, 加1行, 設定module為Test CCD4-color, 如排序時一樣, 但collection time改為1min, 以測毛細管裝置是否妥當, 若baseline值<2,068則可. 再按Run則開始. 在run時, 可隨時由電腦監看.

4.     設定GeneScan M